发酵工程_补充版.doc

生物转化：是指利用微生物细胞或酶对一些化合物的某一特定部位（基团）进行催化修饰，使其转变成结构相似但具有更大经济价值的化合物。发酵工业应用的可培养微生物通常分为四大类：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌（霉菌）。微生物生活环境：放线菌（含有机质丰富的微碱性土壤）、酵母菌（含糖较多的酸性环境）、霉菌（偏酸性环境）微生物生长特征：细菌：较典型的二分分裂方式繁殖。细胞生长时，环状DNA染色体复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。放线菌：主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。酵母菌：主要以出芽方式进行无性繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始出芽。芽长大的同时母细胞缩小。在母细胞与子细胞之间形成隔膜，最后形成同样大小的子细胞。若子细胞不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝。霉菌：以无性孢子和有性孢子进行繁殖，多以无性孢子繁殖。其生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性状的控制，又受环境的影响。菌丝或呈分散生长，或呈团状生长。未培养微生物：是指迄今为止所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物。微生物菌种的分离筛选步骤：样品采集、样品的预处理、目的菌富集培养、菌种初筛、菌种复筛、菌种发酵性能鉴定、菌种保藏。诱变剂：凡能诱发微生物基因突变，使突变频率远远超过自发突变频率的物理因子或化学物质，称为诱变剂。菌种退化：主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。菌种保藏的方法：斜面低温保藏法（低温4）砂土管保藏法（低温、干燥、隔氧、无营养物）冷冻真空干燥法（低温、干燥、缺氧）液氮超低温保藏法大规模工业微生物发酵培养基的共性：单位培养基能够产生最大量的目的产物；能够使目的产物的合成速率最大；能够使副产物合成的量最少；所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、易于长期获得；所采用的培养基尽量不影响工业好气发酵中的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理等。生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。前体：是指加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。产物合成促进剂：是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显著提高发酵产量的一些物质，常以添加剂的形式加入发酵培养基中。青霉素G的前体：苯乙酸及其衍生物 青霉素V的前体：苯氧乙酸灭菌：用物理或化学方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。除菌：用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。消毒：用物理或化学方法杀死空气、地表及容器和器具表面的微生物。防腐：用物理或化学方法杀死或一直微生物的生长和繁殖。发酵工业的无菌技术：干热灭菌法（恒温电热干燥箱，胶皮、塑料、培养基不能）湿热灭菌法射线灭菌法（物体表面、超净台、培养室）化学药剂灭菌法（发酵工厂环境）过滤灭菌法（无菌空气）火焰灭菌法（金属小用具）发酵用无菌空气的质量标准：连续提供一定流量的压缩空气，VVM的含义，即单位时间单位体积培养基中通入标准状态下空气的体积，一般为0.1-2.0；空气的压强（表压）为0.2-0.4 MPa；进入过滤器前，空气的相对湿度70%；进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30；压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败率为0.001为指标，也可把100级作为无菌空气的洁净指标100级指每立方米空气中，尘埃粒子最大允许值0.5m的为3500，5m的为0；微生物最大允许数为5个浮游菌/m3，1个沉降菌/ m3。过滤除菌机理：当气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气流大小和方向的绕流运动，从而导致微生物颗粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留、捕集在纤维表面上，实现过滤的目的。提高过滤除菌效率的措施：减少进口空气的含菌数量；设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质；针对不同地区，设计合理的空气预处理流程，以达到除油、水和杂质的目的；降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作；稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。种子培养：是指将冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这种纯培养物称为种子。接种龄：是指种子罐中培养的菌丝体转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。在微生物发酵中，底物主要消耗在以下三个方面：用于合成新的细胞物质；用于合成代谢产物；提供细胞生命活动的能量。呼吸强度：指单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，mmol O2/(kg干菌体h)摄氧率（耗氧速率）：指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量。mmol O2/(m3h)呼吸强度和耗氧速率之间的关系：=Qo2X菌体摄氧率，mmol O2/(m3h);Qo2菌体呼吸强度，mmol O2/(kg干菌体h);X菌体浓度，kg干重/m3。发酵热：在发酵过程中，引起温度变化的原因是由于发酵过程中所产生的净热量，称为发酵热。它包括生物热、搅拌热、蒸发热、通气热、辐射热和显热等。Q发酵Q生物Q搅拌Q通气Q蒸发Q辐射 H（H反应物）（H产物）发酵过程pH变化的原因：基质代谢产物形成菌体自溶pH调控方法：配制合适的培养基，调节培养基初始pH至合适范围并使其有很好的缓冲能力；培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂，如CaCO3等防止pH过度下降；培养过程中加入基质性酸碱调节剂，如氨水等；加生理酸性或碱性盐基质，通过代谢调节pH；将pH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制pH。溶解氧在发酵过程控制中的重要作用：溶解氧判断操作故障或事故引起的异常现象；溶解氧判断中间补料是否恰当；溶解氧判断发酵体系是否污染杂菌；溶氧作为控制代谢方向的指标。泡沫控制方法：机械消泡；化学消泡剂消泡泡沫的控制，可以采用三种途径：调整培养基中的成分或改变某些物理化学参数或者改变发酵工艺来控制，以减少泡沫形成的机会；采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫；可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。发酵工业常用的消泡剂分为：天然油脂类、聚醚类、高碳醇类、硅酮类。淀粉的糖化：将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖，主要成分是葡萄糖。淀粉水解糖的制备方法：酸解法酶解法酸酶结合法 淀粉制糖过程考察指标：葡萄糖的理论收率实际收率淀粉转化率葡萄糖值DX值（糖化液中的葡萄糖含量占干物质的百分率）尾气分析内容：包括CO2的测量及O2的分析尾气CO2的测量: 常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高,可达 0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.6-2.9m和4.1-4.5m之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。尾气氧的仪器分析: 采用热磁氧分析仪测定。原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。、铜制器皿中不能通氨气的原因：通氨气时，氨浓度较大，不可避免有水和氧气存在，会使氨和铜发生络合反应形成稳定的铜氨络合物，从而腐蚀器皿；同时可溶性铜盐有毒，会使蛋白质变性，失去生理活性，从而抑制了微生物生长，对发酵产生影响。装青霉素的铁罐内壁涂层原因：三价铁离子浓度对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液中铁离子含量超过20g/ml，则青霉素合成速度减缓，要控制铁离子浓度，除了培养基比和水质外，还要防止铁制容器内壁上的可溶性铁离子溶解到发酵液中来，因此铁罐内壁在使用前必须进行处理。重组大肠杆菌高密度培养过程中1、乙酸的产生：当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸， 乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关，乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。2、如何减少或避免乙酸的形成：宿主菌：不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶突变或活性降低，使乙酸合成受阻；改变培养基组成特别是碳源的含量能影响乙酸的产生（在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基中产生少，用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，加入甘氨酸、甲硫氨酸等可以减轻乙酸的抑制作用，提高了重组菌生长速率和重组蛋白的产率）；降低比生长速率：细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高；降低培养温度：将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成；利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量；限制性流加葡萄糖：控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。啤酒生产工艺流程中大麦浸渍的目的为：使大麦吸收充分的水分，达到发芽的要求;在浸水的同时，可充分洗涤、除尘和除菌;浸麦水中添加石灰乳、Na2CO3、NaOH、KOH、甲醛等化学药品，加速酚类、谷皮酸等有害物质的浸出，并有明显的促进发芽和缩短制麦周期之效，能适当提高浸出物。麦汁的煮沸：煮沸的目的是稳定麦汁的成分，其作用是：蒸发多余的水分，浓缩到规定的浓度；使酒花中的有效成分溶解于麦芽汁中，使麦汁具有香味和苦味；使麦汁中可凝固性蛋白质凝结沉淀，延长啤酒的保存期；破坏全部的酶和麦芽汁杀菌。酒花主要作用：赋予啤酒香气和爽口的苦味；提高啤酒泡沫的持久性；使蛋白质沉淀，有利于啤酒的澄清；酒花本身有抑菌作用，增强麦芽汁和啤酒的防腐能力。 工艺技术改革主要方式：改变原料、改进生产设备、改革生产工艺、优化工艺控制过程。例1 ：某发酵罐，内装培养基40m3，在121 下进行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，求理论灭菌时间？若采用连续灭菌，灭菌温度为131，此温度下的灭菌速度常数为0.25s-1，求灭菌时间？解：N0 =40106 107 =41014Nt =0.001（灭菌结束后培养基中活微生物数，一般取0.001，即灭菌失败的概率为千分之一）lg k = - 14845/T+36.127=-14845/（273+121）+36.127 = -1.55k = 0.0281s-1= 1/k In(N0 / Nt) = 1442.6s = 24min当采用连续灭菌时，=1/k In(N0/Nt)=1/0.25 ln(41014/0.001)=162s=2.74min例2：某发酵罐内装培养基40m3,在121oC下进行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，已知升温阶段培养基从100oC升到121oC需要20min，考虑这一阶段的灭菌作用，求保温时间？解：升温阶段，k不是常数，随温度变化，由图解积分法可得 Km=0.128/(394-373)=0.0061 s-1则保温阶段：lg k = - 14845/T+36.127=-14845/（273+121）+36.127 = -1.55k = 0.0281s-1例3：推导单极连续培养过程达到稳定状态时比生长速率与稀释率的关系式=D答： 对菌体有：（X为细胞量，V为发酵罐中原有培养液体积，F为流速）当过程达到稳态时，细胞浓度是个常数，即恒浊培养此时，所以上式可变为 ，即。例4：60000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸？若前体单耗为0.337（kg/10亿青霉素），求实际转化率？解： 青霉素600000.6g36mg/ml 苯乙