植物组织培养实验.doc

实验一 植物组织培养实验室的构造和功能一、目的要求：掌握如何组建植物组织培养实验室，熟悉组培中设计的各种仪器设备和器皿用具。二、仪器与用具超净工作台、空调机、蒸馏水发生器、高压灭菌锅、低温冰箱、普通冰箱、电磁炉、各种电子天平、pH仪器等设备，以及各种试验器皿和器械用具等。三、方法步骤1.了解组织培养实验室守则以及有关注意事项。2.掌握仪器设备和器皿用具的名称与用途以及实验室的构造。3.参观组培实验室的构建情况，包括准备室（化学实验室）、缓冲室、无菌操作室（接种室）和培养室的设计要求，以及内部仪器设备的名称及其作用。四.实验报告1.将本次实验内容整理成实验报告2.设计一个植物组织培养实验室的组建方案。实验二 MS培养基母液的配制与保存一、目的要求通过MS培养基母液的配制与保存，掌握配制与保存培养基母液的基本技能。二、材料与用具配制MS培养基所需的药品（见附表）。植物生长调节物质、各类天平、烧杯、容量瓶、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl、母液瓶、标签、冰箱等。三、方法与步骤1.母液的配制(将MS母液配置表画在黑板上，举例讲解母液的配制过程，包括称量、溶解、定容三步，再将班级分为五个组进行配制)2.植物生长调节物质母液的配制称量：用微量0.001或0.0001的分析天平或由电子天平准确称取生长素（或细胞分裂素）50mg。溶解：生长素（如IAA、IBA、NAA、2、4-D）可用少量的0.1mol/LNaOH溶解，细胞分裂素（如KT、ZT、6-BA）可用0.1mol/L的HCl加热溶解。定溶：将溶解的植物生长调节物质倒入50ml容量瓶，用水冲洗小烧杯数次，最后加蒸馏水定容至50ml，配制成浓度为1mg/ml的溶液。3.母液的保存装瓶：将配好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培养基名称、母液号、配制倍数（或浓度）以及配制日期。储藏：将母液瓶储放在4冰箱内备用。四、实验报告将本次实验内容整理成实验报告（叙述母液配置过程）。附表 MS培养基母液配制（单位：mg）母液成分规定量扩大倍数称取量母液体积(ml)配1L培养基吸取量（ml）编号种类1大量元素KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4190016503701701010101019000165003700170010001002钙盐CaCl233210332010001003微量元素MnSO4.H2OZnSO4.7H2OH3BO3KINaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16.98.66.20.830.250.0250.02510010010010010010010084543031041.512.51.251.25500104铁盐Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.334.510010018651725500105维生素甘氨酸盐酸硫胺素(VB1)盐酸吡哆醇(VB6)烟酸肌醇2.00.10.50.510010010010010010010052525500050010注意：配制前核实各种化学成分的含水量实验三 固体培养基的配制一、目的要求通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。二、材料与用具MS培养基母液、植物生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、移液管、量筒、容量瓶、电磁炉、酸度计、0.1mol/LNaOH(HCl)、培养瓶、记号笔等。三、方法与步骤1按母液顺序和规定量，用量筒和移液管提取母液，放入1000ml的容量瓶中，MS1-100ml、MS2-100ml、MS3-10ml、MS4-10ml、MS5-10ml。2.加入植物生长调节剂，加入的种类与数量，视培养物不同而异，有时也可不加。3.加入蔗糖若干，溶解定容至1000ml，再放入9g琼脂。4.调整PH值，经酸度计测试，用0.1mol/LNaOH（HCl）把培养基PH值调整至5.8-6.0。5.在电磁炉上加热溶液，并不断搅拌，使琼脂不断熔化。6.分装培养基，把配好的培养基分装到50-150ml的培养瓶中，分装后立即加盖封口，用记号笔注明培养基名称。四、实验内容配制火鹤培养基：MS+NAA0.2 mg/mL +蔗糖30g+琼脂9g，PH5.8-6.0。五、实验报告根据实验内容总结出固体培养基配制的具体过程。实验四 培养基和培养用具的灭菌一、目的要求通过对培养基和培养用具的灭菌，掌握高压灭菌和干热灭菌的一般操作技术。二、材料与用具培养皿、三角瓶、注有培养基的培养瓶、装有蒸馏水的玻璃瓶、牛皮纸、镊子、剪刀等金属器械、高压灭菌器、烘箱等。三、方法与步骤1.高压灭菌锅：洗涤包扎装水（需淹没电热丝）灭菌：把需灭菌的物品放入高压灭菌锅内，当压力达120kpa，锅内的温度为121时，保持30min。关掉开关，打开放气阀，让灭菌锅自然冷却。储藏：待灭菌锅内的气体放尽，把物品从灭菌器中取出，培养基要放置在温度低于30，没有强光照射的专用柜中备用。2.干热灭菌洗涤灭菌：把洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150温度下，干热灭菌1h或120温度下2h灭菌完毕，待冷却后取出。四、实验报告高压灭菌前后应注意哪些事项？实验五 无菌操作技术一、目的要求通过在超净工作台上进行无菌操作训练，初步掌握组织培养的无菌操作技术。二、材料与用具超净工作台、70%的酒精、95%的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精等、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0.1%的升汞或“84”灭菌液、无菌水等。三、方法步骤1.用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2.打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射20min。3.操作前10min使超净工作台处于工作状态，让过滤室空气吹拂工作台面和四周的台壁。4.照射20min后，关闭紫外灯。5.用70%的酒精擦拭工作台和双手。6.用蘸有70%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放入工作台。7.用解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。8.把培养材料放进70%的酒精中浸泡30s,再用0.1%的升汞（氯化汞，HgCl2）中浸泡10min,或在“84”灭菌液（经无菌水1：1的稀释）中浸泡10-15min,浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗4-5次。9.用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶口。10.取下接种器械，在火焰上灭菌。11.将灭菌后的培养材料在无菌的培养皿中切割成11cm大小，然后放入培养瓶，盖上瓶口。操作期间应经常用70%酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌。12.接种结束后，清理和关闭超净工作台。四、实验报告1.将本次实验内容整理成实验报告。2.接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。实验六 火鹤的增殖培养一、目的要求通过学习火鹤的组织培养的基本方法和步骤，熟练掌握组织培养的无菌操作技术。二、材料与用具1.材料：火鹤试管无菌苗2.仪器：超净工作台、解剖刀、长把镊子、无菌培养皿、培养瓶等3.培养基：MS+NAA0.2mg/mL+蔗糖30g+琼脂9g PH：5.8-6.0三、方法步骤1.选取生长健壮，长约5cm以上的火鹤试管苗。2.在超净工作台上用蘸有70%的酒精擦拭双手和工作台以及装有培养基的培养瓶。3.在酒精灯火焰下烧培养瓶瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。4.打开长有火鹤的培养瓶瓶盖，用长把镊子取出火鹤试管苗，放入灭过菌的培养皿中。5.用手术刀将火鹤幼苗切成1.5cm长的小段，每段带有1-2片幼叶。6.盖好瓶盖，注明品种及接种日期，放入培养室培养。7.定期观察植株的生长、分化情况。四、实验报告通过火鹤茎段培养的基本方法和步骤，制定出杜鹃的微扦插繁殖方案。实验七 杜鹃茎段的微扦插繁殖一、目的要求通过学习杜鹃茎段培养的基本方法和步骤，学会和掌握试管微扦插繁殖的基本技术。二、材料与用具杜鹃试管无菌苗、超净工作台、解剖刀、长把镊子、无菌培养皿、培养瓶等培养基：DJ+NAA0.05mg/mL+ZT0.5 mg/Ml+蔗糖30g+琼脂9g PH：5.0三、方法步骤1.选取生长健壮，长约5cm以上的杜鹃试管苗。2.在超净工作台上用蘸有70%的酒精擦拭双手和工作台以及装有培养基的培养瓶。3.在酒精灯火焰下烧培养瓶瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。4.打开长有杜鹃的培养瓶瓶盖，用长把镊子取出杜鹃试管苗，放入灭过菌的培养皿中。5.用手术刀将杜鹃幼苗切成1.5cm长的小段，每段带有1-2片幼叶。6.将切好的茎段插入培养基中，保持茎段高度一致。7.盖好瓶盖，注明品种及接种日期，放入培养室培养。8.定期观察植株的生长、分化情况。四、实验报告将本次实验内容整理成实验报告，并观察记录杜鹃的生长分化情况。实验八 蝴蝶兰原球茎的增殖培养一、目的要求通过对蝴蝶兰原球茎增殖的继代培养的操作，掌握蝴蝶兰原球茎增殖的基本技术和基本方法。二、材料与用具1.材料：培养瓶中蝴蝶兰原球茎。2.仪器：超净工作台、无菌培养皿、长把镊子、解剖刀等。3.培养基： 1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖20g+琼脂9g PH:5.8 KC+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g+琼脂9g PH:5.8三、方法步骤在超净工作台中，用长把镊子将蝴蝶兰的原球茎取出，放在无菌培养皿中，用解剖刀将其切成0.5cm左右的小块，移入上述两种培养基中，每瓶放入20块左右，盖好瓶塞，注明品种名称、接种日期、接种人，最后放入培养室中培养，定期观察其生长及增值情况。四、实验报告 叙述上述两种培养基的制作过程及原球茎继代增值的操作要点。实验九 蝴蝶兰的定植与移栽一、目的要求熟练掌握蝴蝶兰定植与移栽的操作步骤。二、材料与用具蝴蝶兰组培苗、长把镊子、解剖刀、培养基、草炭、塑料小钵等。三、方法与步骤 1.定植：在超净无菌的条件下，用镊子将蝴蝶兰的组培苗取出，组培苗大小不一，将打的组培