蜡样芽胞杆菌及检验.doc

蜡样芽胞杆菌及检验在Bergey氏鉴定细菌学手册第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。一、生物学特性1、形态特性蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.33-5m，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。2、培养特性蜡样芽胞杆菌生长温度为25-37，最佳温度30-32。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。3、生化特性表1：蜡杆芽胞杆菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别特 性蜡样芽胞杆 菌苏云金杆 菌蕈状芽胞杆 菌炭 疽杆 菌巨大芽胞杆 菌革兰氏染色+a+过氧化氢酶+动 力+/-b+/-c-+/-硝酸盐还原+/-+-d分介酪氨酸+/-d+/-抗溶菌酶+-卵黄反应+-厌氧利用葡萄糖+-VP反应+-甘露醇产酸-+溶血（羊红细胞）+-d-已知致病特性产肠毒素晶体内毒素对昆虫致病根状生长人畜共患a+，90-100% 菌株是阳性；b+/-，50-50% 菌株是阳性；c-， 90-100% 菌株是阴性；d-，绝大多数菌株是阴性。4、耐热性蜡杆芽胞杆菌耐热，其3716小时的肉汤培养物的D80值（在80时使细菌数减少90%所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌（2.4107/mL）转为阴性需10020分钟。其游离芽胞能耐受10030分钟，而干热灭菌需12060分钟才能杀死。二、流行病学1、细菌分布蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。2、流行情况蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。3、临床症状当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。三、致病性蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。表2：蜡样芽胞杆菌腹泻和呕吐毒素的性状性 状腹泻毒素呕吐毒素分子量55-6.01035000稳定性56 5分钟、pH3或11毒性消失11510分钟、pH2或11.2小时毒性残存活 性致猴腹泻对胰蛋白酶敏感致猴呕吐对胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受抗原性特异性抗体中和试验阳性无抗原性四、检验和控制A、样品制备无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。加Butterfields磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。B、蜡样芽胞杆菌平板计数移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。将平板置30培养24小时，并检查菌落周围有沉淀圈者，表示产生卵磷脂酶。蜡样芽胞杆菌菌落通常是粉红色，随着培养时间的延长则更明显。如果上述反应不清晰，应将平板再培养24小时后计数，从MYP平板上挑取典型菌落5个或更多，移种到营养琼脂斜面上供蜡样芽胞杆菌证实试验用。C、蜡样芽胞杆菌的最大近似数MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。将培养管置30培养482小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于30培养24-48小时。以下步骤同B。D、蜡样芽胞杆菌的证实试验从MYP琼脂平板上挑取5个或更多的伊红粉色，卵磷脂酶阳性的菌落，移种到营养琼脂斜面上，置30培养24小时。取培养物作了革兰氏染色和显微镜观察。再用3mm直径的接种环取培养物到装有0.5mL灭菌磷酸缓冲稀释液的13100mm试管中，充分混悬均匀。用于下列试验。酚红葡萄糖肉汤硝酸盐肉汤改良的V-P培养基酪氨酸琼脂溶菌酶肉汤MYP琼脂蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件。1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；4）还原硝酸盐；5）VP阳性；6）分介L-酪氨酸；7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。E、蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验从表1可见D部分所述的生化特性为蜡样芽胞杆菌群所共有。要鉴别