基于CHD基因序列分析的帝企鹅性别鉴定研究.doc

基于 CHD 基因序列分析的帝企鹅性别鉴定研究沈 玮 ,潘少坤 ,罗红梅 ,刘 伟 ,朱 标 ,曹祥荣 3(南京师范大学生命科学学院 ,江苏南京 210046 )摘要目的 分析帝企鹅 (A ptenody tes forsteri) CHD 基因序列 ,以鉴定性别 。 方法 采用苯酚 氯仿抽提法提取 6只未知性别的帝企鹅血液中的基因组 DNA ,运用 P2 / P8引物扩增 CHD 基因片段 ,将 PCR 产物克隆到 T2V ector,利用 NCB I的 B last程序 ,以短趾鹰 ( C ircaetus ga l2licus)同源序列为比对参照 ,将帝企鹅 CHD 基因片段序列与 GenB ank 中的基因片段序列进行同源性比较分析 ,鉴定帝企鹅的性别 。 结果 测序结果表明 , CHD 2Z和 CHD 2W 基因的 PCR 产物大小分别为 378、387 bp ,雌雄结果并不明显 ,不易区分开来 。B la st比对结果表明 ,帝企鹅 LD、EK、ZF为雄性 ,帝企鹅 D G、YA、YY为雌性 。 结论 结合 PCR 扩增和测序分析 CHD 基因 ,是单态性鸟类性别鉴定的有效和准确的方法 。关键词帝企鹅 ; CHD 基因 ;测序 ;性别鉴定中图分类号S 835文献标识码 A文章编号 0517 - 6611 ( 2010) 03 - 01167 - 02Study on Sex Iden t if ica t ion of Em peror Pen gu in ( A p ten odytes fo rs te r i) Ba sed on Sequen ce Ana lysis of the CHD Gen eSHEN W e i e t a l( Co llege of L ife Sc ience s, N anjing No rm a l U n ive rsity, N an jing, J iangsu 210046 )A b stra c t O bjec tive The re sea rch a im ed to ana lyze the CHD gene sequence of Emp e ro r Pengu in (A ptenody tes forsteri) to iden tify its sex. M e thod The gene tic DNA wa s extrac ted from the b lood of 6 A. forsteri wh ich sex wa s unknown. The PCR amp lified fragm en ts w ith p rim e rs P2 / P8 we re c loned in T2V ec to r. Tak ing homo logous sequence of C ircaetus ga llicus a s refe rence, the CHD gene sequence wa s compa red to the homo logue s in GenB ank to identify its sex. R e su lt The sequenc ing re su lts showed tha t the PCR p roduc ts of CHD - Z and CHD - W we re378、387 bp re sp ec tive ly, and sex cha rac te r wa s no t significan t fo r d ivid ing sex. The B la st comp a ra tive re su lts showed tha t A. forsteri LD , EKand ZF wa s m a le, and A. forsteri D G, YA and YY wa s fem a le. Conc lu sion The m e thod of com b in ing PCR amp lifica tion and sequenc ing to ana lyze the CHD gene is an accu ra te and re liab le way to de te rm ine sex of monomo rp hic avian.Key word sEmp e ro r Pengu in (A ptenody tes forsteri) ; CHD gene; Sequenc ing; Sex iden tifica tion胸类鸟类都具有 CHD 2W 基因 8 - 9 。目前 ,引物 P2 / P8 已成为运用 CHD 基因进行鸟类性别鉴定最普遍的引物 。为此 ,笔者选用了引物对 P2 / P8 扩增性别基因 CHD 上的特定片 段 ,将 PCR 产物进一步克隆测序 ,并用 B la st软件进行序列同源性比对分析 ,对未知性别的 6 只帝企鹅进行性别鉴定 ,旨 在探索一种简便且准确度高的帝企鹅性别鉴定方法 。1材料与方法皇帝企鹅 (A ptenody tes forsteri) ,简称帝企鹅 Empe ro r Pen2gu in,是现存企鹅家族中个体最大的 ,是企鹅世界中的巨人 。 帝企鹅在分类学上属企鹅目企鹅科王企鹅属 ,它是一种单态性鸟 ,其性别 (尤其是在幼鸟时期 )无论是从外观上还是行为上都很难作出判别 ,在人工养殖时 ,给配对造成了很大的困 难 。帝企鹅是世界上濒临灭绝的企鹅之一 ,并且目前对它的研究尚很少 。随着其个体数量的急剧下降 , 为了保存该物 种 ,对其进行行为生态学的研究显得尤为重要 。而性别鉴定又是考察其性别差异 、性行为及繁殖特征的首要前提 ,对于 笼养的企鹅而言 ,成功地鉴定性别还可以人为地大大提高繁殖率 1 。目前 ,传统的对单态性鸟性别的鉴定方法有 : 目测性器 官 ;通过组织培养进行染色体分析 ;测定粪便中雌激素与睾酮的比例 ;对性腺进行直接造影的内窥镜及超声波检查 ;体尺测量法 ;用录音机录下鸣叫声比较声波频率等 2 。鸟类的 性染色体为 ZW 型 ,雄性为 ZZ,雌性为 ZW。目前 ,利用 PCR技术扩增性别相关基因的特定基因片段已经开始应用到对 单态性鸟的性别鉴定中 ,与传统的方法相比 ,这种方法既避免了解剖观察性器官造成的鸟类的死亡 ,也克服了制作染色 体样本的高难度 3 。目前 ,对于非平胸鸟类来说 ,应用最多的是 CHD 基因 (染色体螺旋蛋白基因 , ch romobox2he lica se2DNA bind ing gene) ,鸟类的 CHD 基因位于性染色体上 , CHD基因在非平胸鸟类中有 2 个同源拷贝 CHD 2W 和 CHD 2Z,其 中 , CHD 2W 为 W 连锁 , CHD 2Z为 Z 连锁 4 - 7 。尽管 CHD 基因不是鸟类性别决定基因 ,但非常保守 ,并且几乎所有非平1. 1 材料血液样本取自南京海底世界的 6 只帝企鹅 ,其性别均未知 ,编号分别为 LD、D G、EK、YA、YY、ZF, - 20 冰箱短期保存 。1. 2 方法1. 2. 1 帝企鹅基因组 DNA 的提取 。采用苯酚 氯仿抽提法 。 取 200 l冻存血液 10 ,在 37 水浴中融化 ,加入等体积的 PB S, 3 500 r /m in离心 15 m in。弃去上清液 ,加入等体积裂解液 ( 0. 5% SD S, 10 mmo l /L Tris2HC l, pH 值 8. 0, 0. 1 mo l /L ED TA )及 2. 5l 10 m g /m l蛋白酶 K,于 50 下缓慢摇动 3h。充分裂解后 ,用等体积的酚 氯仿 ( 1 1)抽提 3 次 ,等体积 氯仿抽提 1次 ;得上清液中加入 1 /10体积的 3 mo l /L 醋酸钠 和 2倍体积的无水乙醇 ,沉淀 , 70%冰乙醇洗沉淀 1 次 ;最后 用 50100l的双蒸水溶解沉淀 。1. 2. 2PCR 反应 。以所得的基因组 DNA 为模板 ,进行 PCR反应 ,反应体系 25 l: 1 U exTaq DNA 聚合酶 , 200 mmo l /LM gC l2 , 10 pmo l引物 ,约 100 ngDNA 模板 ,加入去离子水至 25l。扩增程序为 : 94 5 m in; 94 30 s, 47 40 s, 72 1 m in, 40个循环 ; 72 7 m in; 4 (保存 ) 。所运用的 1对引物 为 : P2 ( 52TCTGCA TCGCTAAA TCCTTT23) 和 P8 ( 52CTC2基金项目 国家自然科学基金资助项目 ( 30771172 ) 。作者简介 沈玮 ( 1986 - ) ,女 ,江苏吴江人 ,研究生 ,从事细胞生物学方 8 。CCAA GGA TGA GRAA YTG23)PCR 产物克隆 、测序及比对分析 。取 4 l PCR 扩增1. 2. 3面的研究 。 3 通讯作者 ,教授 ,博士生导师 , E2m a il:grong n jnu. edu. cn。收稿日期 2009 209 224caoxian2产物 ,在 0. 8%的琼脂糖凝胶上电泳 30 m in,用凝胶成像仪进行拍照记录 。将 PCR 产 物 进 行 纯化 、克 隆 、测 序 , 然后 用鉴别了 3种鹤的性别 14 。A. O gawa等利用荧光标记性染色体基因探针 、Southe rn 杂交可以鉴定几乎所有的鸟类 (包括 平胸鸟类 )的性别 15 。后来发展到用 PCR 方法扩增性染色体连锁基因的特异 性区段序列 ,根据 Z /W 染色体分布及序列的差异 ,判断鸟类性别 。CHD 基因在所有非平胸鸟类中都保守表达 ,在 Z和W 染色体上各有 1个拷贝 ,因此 , CHD 基因能够作为非平胸 鸟的通用标签 ,从而可以快速简便地鉴定鸟类性别 。引物P2 / P8是用 CHD 基因进行鸟类性别鉴定的最普遍的引物 ,Griffiths等利用引物 P2 和 P8 对鸡形目等 18个目的 28个种 的鸟类进行了性别鉴定 ,其中 ,只有对平胸鸟类中的鸵鸟不能作出正确的判断 , 从而断定该方法对非平胸鸟类具有广 适性 8 。江杉等利用引物 P2 / P8 扩增 CHD 基因片段 ,成功B last比对分析序列 ,鉴定帝企鹅的性别 。2 结果与分析2. 1 CHD 基因片段扩增结果利用 P2 和 P8 引物扩增CHD 基因相应片段 ,其结果见图 1。从图 1 可以看出 ,雌雄结果并不明显 ,几乎均只能看见 1 条条带 。经测序后表明 ,CHD 2Z和 CHD 2W 基因的 PCR 产物分别为 378、387 bp ,因此 琼脂糖凝胶不易区分开来 。注 : M 为 DNA 分子质量标准 ; 1 8 为 P2 / P8 的扩增产物 ,分别为阳性对照雌鸡 、雄鸡和帝企鹅 LD、D G、EK、YA、YY、ZF。No te: M. DNA mo lecu lar weight standard; 1 - 8. Amp lification p rod2ucts of P2 / P8, wh ich are po sitive con tro l fem ale ch icken and 16 鉴别鹳形目 5种鹭科鸟类和 1种鹮科鸟类。在帝企鹅中 ,从 Z染色体上扩增出的 CHD 2Z基因大小 为 368 bp ,而从 W 染色体上扩增出的 CHD 2W 的大小为 388bp ,这样 ,理论上雌性个体的 PCR 产物中会出现 2 条条带 。cock, emp ero r p engu in LD , D G, EK, YA , YY, ZF, tively.图 1 利用引物对 P2 / P8扩增 CHD 基因结果resp ec2雄性中只有 1条条带 。然而 ,由于 CHD 2Z和 CHD 2W 的大小差别不大 ,琼脂糖凝胶电泳难以区分开来 ,因此给判别带来 了困难 。在其他一些物种中 ,也出现过类似的现象 。面对这种情况一般采取的进一步方法有 : 改用变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测 ; 采用限制性内切酶对 P2 / P8 的 PCR 扩增产物进行酶切 ,然后再用琼脂糖凝胶电泳检测 。 Sacch i等利用 限制性内切酶 A sp700 I对 P2 / P8 的 PCR 扩增产物进行酶F ig. 1 Polym era se cha in react ion of CHD w ith pr im ers P2 / P82. 2 PCR产物测序结果及其 B la st比对分析结果 将 PCR 产物克隆到 T2V ec to r,每只企鹅分别挑取了 3 个克隆进行测 序 ,利用 NCB I的 B last 程序 ,以短趾鹰 ( C ircaetus ga llicus)同 源序列为比对参照 ,将帝企鹅 CHD 基因片段序列与 GenB ank 中的进行同源性比较分析 。对 B last测序结果进行分析 ,出 现 CHD 2W ,则可以判定该帝企鹅个体为雌性 ( ZW 型 ) ,若仅 出现 CHD 2Z,则判定该个体为雄性 ( ZZ型 ) 。从表 1 可以看 出 ,帝企鹅 LD、EK、ZF为雄性 ,帝企鹅 D G、YA、YY为雌性 。表 1 6只帝企鹅 CHD 基因序列比对与性别鉴定结果Ta ble 1 CHD gen e sequen ce a l ignm en t and gen der iden t if ica t ion re2su lts of 6 Em peror Pen gu in s切 ,成功地对短尾鹰 ( C ircaetus ga llicus)进行了性别鉴定 17 。针对 CHD 基因其他靶序列设计引物 。1999年 , F rido lfsson等设计了 1对引物 2550F /2718R ,成功判断小海雀 (A eth ia pyg2m aea)的性别 9 。田秀华等使用引物 2550F / 2718R ,对 7 种 鹤形目鸟类 :大鸨 (O tis ta rda) 、丹顶鹤 ( G rus japonensis) 、蓑羽鹤 (A n th ropoides virgo ) 、灰 鹤 ( G. g rus ) 、白 鹤 ( G. leucogera2nus) 、白头鹤 ( G. m onacha )和灰冠鹤 (B a lea rica regu lorum )共 18 48 只鸟进行了有效的性别鉴定。胡锐颖等同样以 2550F和 2718R 为 CHD 基因扩增引物 ,成功地鉴定了绿孔雀 、丹顶 鹤 、戴冕鹤 、白鹤 、黑颈鹤 、白头鹤 、灰鹤 、白枕鹤 、东方白鹤等与短趾鹰 CHD 基因的同源性 % Homo logy to CHD of C ircaetus ga llicus样本编号Samp lecode鉴定性别Iden tified sexCHD 2WCHD 2ZLD D G EK YA YYZF918491919192 19 9种 86只国家一级保护鸟类的性别。该研究对 PCR 产物进一步进行 CHD 基因序列分析 ,采用B last序列比对分析 ,依据 CHD 2Z或 CHD 2W 基因的同源性鉴 定出帝企鹅的性别 ,为其他单态性鸟类的性别鉴定开辟了一条新道路。与鸟类性别鉴定的其他方法相比 ,该研究将 PCR 方法与 B last相结合具有以下一些优点 : 采样量小 ,取样容易 ,非常安全 ,取样过程中对鸟造成的应激反应较小 ; 利用稳定 遗传的基因组 DNA 来鉴定性别 ,解决了 CHD 2Z和 CHD 2W 基因大小差别不大造成难以准确判定的困难 ,不依赖于较难区别的外部形态 ,结果更可靠 ; PCR 鉴定不受年龄的限制 ,所以 ,即使是刚出生的雏鸟也可以鉴定性别 ; 操作简便 ,周期短 ,通 用性高 ,便于推广普及。PCR 法能够快速、准确地鉴定鸟类性别 ,这种技术将为今后人工饲养繁殖濒危鸟类和国际交流濒危鸟类提供可靠的技术资料 ,对鸟类生态学、细胞遗传学、进化生 物学和分类学的研究都有重要的意义。(下转第 1214页 )9292913 讨论鸟类的基因型为 ZW 型 (雌性为 ZW ,雄性为 ZZ) 。由于 生态环境的恶化和捕杀 ,很多鸟类已经陷入了濒危境地 ,因 此多采取笼养繁殖 、再放回自然保护区进行鸟类多样性的保 护 ,亲本鸟类性别鉴定对于有效的繁殖至关重要 。全世界大部分的鸟类是单态性鸟 ,即雌雄同型 ,即使对于一些雌雄异 型鸟类 ,只有在性成熟后 ,雌雄在形态上才有区别 ,所以对鸟 类进行性别鉴定是非常困难的 ,特别是对雏鸟进行安全和准 确的性别鉴定就更加不易 。因此 ,分子生物学手段便成为鸟 类性别鉴定的重要和更有效的方法 ,最初使用的是 RA PD 11 和 R FL P 12 - 13 等方法 。国内 ,杨光等也利用 RA PD 方法成功理单个盐藻细胞中 2胡萝卜素和蛋白质含量最高的现象 ,可能仅是在高浓度硼铜组合逆境条件下 ,盐藻细胞的适应性反 应 。因为此时培养液中的细胞密度 、盐藻蛋白质含量 、2胡 萝卜素含量都很低 。参考文献 1 李正华 ,江树勋 ,蔡桂琴 ,等. 盐藻分子生物学研究概况 J . 海洋科学 ,2005, 29 (6) : 69 - 72. 2 刘亚军 ,赵文. 杜氏藻的生物学和生态学研究进展 J . 大连水产学院学报 , 2004, 19 (2) : 126 - 131. 3 刘成玉 ,王春波 ,蓝孝贞 ,等. 盐藻 2胡萝卜素对恶性肿瘤病人红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的影响 J . 中国海洋药物 , 2000 (1) : 30 - 32. 4 王春波 ,蓝孝贞 ,张晋平 ,等. 盐藻 2胡萝卜素对实验性动脉粥样硬化预防作用的研究 J . 中国海洋药物 , 1998 (1) : 7 - 12. 5 柴玉荣 ,王天云 ,薛乐勋. 新型生物反应器 杜氏盐藻研究进展 J . 中国生物工程杂志 , 2004, 24 (2) : 30 - 33. 6 陈晗华 ,钱凯先. 氮、磷对盐藻生长及其 2胡萝卜素积累的影响 J . 浙江大学学报 :自然科学版 , 1997, 31 (6) : 731 - 736. 7 郝建欣 ,孙钰 ,丛威 ,等. 盐藻生长过程中氮磷利用与色素积累 J . 海洋科学 , 2003 (2) : 41 - 44. 8 杨晓玲 ,郭金耀. 硼对盐藻生长与物质积累的调控作用 J . 盐业与化工 , 2007, 36 (3) : 20 - 22. 9 杨晓玲 ,郭金耀. 铜对盐藻生长与物质积累的调控作用 J . 水利渔业 ,2007, 27 (2) : 84 - 85, 108. 10 郝建军 ,康宗利. 植物生理学 M . 北京:化学工业出版社 , 2005: 142 - 143.图 5 硼铜组合对单个细胞中蛋白质积累的影响F ig. 5 Effects of com b ina t ion of B an d Cu on the pro te in accu2m u la t ion in a sin g le cell 重要作用 。铜也是质蓝素的成分 , 它参与光合电子传递 , 故 对光合有重要作用 10 。试验证明 ,硼铜浓度的不同组合可 对盐藻细胞的生长与物质积累产生明显的调控作用 。培养液中适当的硼铜浓度组合对盐藻细胞的生长和物 质积累有促进作用 ,而硼铜浓度过高或过低都是相对不利的 。在该研究条件下将盐藻的培养基中加入 4 m g /L 硼和125g /L 铜的浓度组合是一种好的选择 。因为它可显著地 促进盐藻细胞的生长 ,使培养液中盐藻细胞的密度大幅度提高 ,有利于通过盐藻细胞获得更多的 2胡萝卜素和蛋白质等 产品 。试验中出现的 6mg / L硼和 1 7 5g / L铜浓 度 组 合 处 11 A I F Q , ZHENG F, SHU Z B , et al. Effects of nitrogen app lication rate, density and seedling age on dry matter accumulation of notillage rape in seedling stage J . Agricultural Science & Technology, 2008, 9 ( 6 ) : 93 -96, 107.(上接第 1168 页 )参考文献 1 CARLOS B , ZAVALAGA , PAREDES R. Sexing determ ination of adult humboldt penguins using morphometric characters J . J Field O rnithol,1997, 68 (1) : 102 - 112. 2 李刚 ,杨水云 ,周航 ,等. 鸟类性别鉴定技术研究进展 J . 动物学杂志 ,2003, 38 (5) : 106 - 108. 3 BUSH M , KENNEDY S,W ILDT D E. Sexing birds by laparoscopy J . IntZoo Yb, 1978, 18: 197 - 198. 4 GR IFF ITHS R , TIWAR I B. Sex of the last wild Sp ixs macaw J . Nature,1995, 375: 4541. 5 GR IFF ITHS R, DAAN S, D IJKSTRA C. Sex identification in birds using two CHD genes J . Proceedings of the Royal Society of London, Series B ,1996, 263: 1251 - 12561. 6 GR IFF ITHS R, KORN R. A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chicken Ga llus dom esticus J . Gene, 1997, 197: 225 - 229. 7 ELLEGREN H. 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