急性髓系白血病干细胞的生物学特性1.doc

白血病干细胞的生物学特性白血病干细胞研究进展急性髓系白血病干细胞的研究进展摘要: 白血病干细胞（leukemia stem cells, LSC）是第一个被确认的肿瘤干细胞, 在白血病的形成与病情的发展中具有重要的作用。深入研究其生物学特性将会为白血病的发病机制及其干细胞靶向治疗奠定理论基础。我国白血病发病率约为2.76/10万。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病居第六位（男）和第八位（女）；我国AL比CL多见（约5.5:1）,其中AML（acute myeloid leukemia）最多（1.62/10万）1，该文介绍急性髓系白血病干细胞的来源、免疫表型、自我更新机制、生存优势及多重耐药、分子调控机制、靶向治疗研究等。关键词：AML，AML-LSC，免疫表型 白血病（leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织是由处于不同分化等级差别的细胞组成的, 而维持这一体系的是其中极少数具有自我更新和增殖能力的肿瘤干细胞。1997 年, Bonnet 等2首先在恶性造血系统肿瘤中证实了肿瘤干细胞, 即白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)的存在, 提出 LSC 是形成白血病的元凶 。那么, LSC有哪些独特的生物学特性， 与正常的造血干细胞相比有哪些异同之处？ 从而导致 LSC 不仅是白血病发生、发展的根源, 而且还是影响疾病预后的重要因素。1AML-LSC的来源 由于HSC和LSC的表型和功能高度相似，人们从正常造血系统分化等级模式中推测LSC可能从正常HSC恶性转化而成2。Bonnet2等从急性髓细胞白血病(AML)患者中首次分离出CD34+、CD38-表型的白血病细胞亚群，将之移植给非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，发现此群细胞表现出干细胞样强大的自我更新、分化和无限增殖能力，能启动除急性早幼粒细胞白血病(M3)外各型AML的形成，并在二次移植受体鼠体内观察到同样的结果。他们认为人类AML起源于原始造血细胞的一个异质群体，即积累突变的HSC。他们研究发现能将白血病移植给NODSCID小鼠的均为CD34+、CD38-的白血病细胞，而CD34+、CD38+白血病细胞不能移植AML至NODSCID小鼠，提示大多数AML转变的靶点是HSC。2AML-LSC的免疫表型免疫表型是细胞功能和身份的标志。LSC 具有干细胞的特性, 也具有与正常造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)相似的免疫表型。研究发现急性髓系白血病(AML)骨髓细胞中存在LSC亚群, 它们能够使NOD/SCID小鼠致瘤。除M3 型外, AML各个型别(M0M5 型)来源的 LSC 均表达相同的免疫表型 CD34+CD38-, 这与正常骨髓 HSC的表面特征相似。CD34+CD38-是人们首次认识到的 LSC表型, 也是目前确认 LSC 的公认标准。此外,LSC 还可表达与 HSC 共同的表型 CD71-、HLA-DR-。与 HSC 表型特征不同的是, LSC 特异性表达 CD90 -CD117 -CD123+ 3。CDl23是人白细胞介素3受体a链(IL-3Ra)，只表达于LSC表面，而HSC几乎不表达，被认为是CD34+CD38-的AML-LSC的独特标记。90%的M3有t（15,17）（q22；q21），该易位使15号染色体上PML（早幼粒白血病）与17号染色体上RARa（维A酸受体基因）形成PML-RARa融合基因。这是M3发病及用全反式维A酸治疗有效的分子基础 1。LSC表达的特异性抗原还有CD33、CD96、CLL-1。Hauswirth等4研究表明CD33表达于大部分AML-LSC表面，而正常HSC不表达。Hosen等5对29例AML患者的研究发现，CD34+CD38-AML细胞中CD96表达率为(74.025.3)%，而在正常HSC中表达率仅为(4.91.6)。进一步将分离得到的CD96+和CD96-。细胞分别移植到受照射的Rag2-/-c-/-新生小鼠中，只有CD96+表型的细胞能移植成功，表明CD96+AML细胞具有LSC活性，提示CD96+是AML干细胞表面特异分子之一。C型凝集素样分子-1(C-typelectin-like molecule-1，CLL-1)是特异表达于AML-LSC表面的抗原，不表达于正常HSC6。2. LSC 的自我更新机制自我更新又称自我复制, 是指干细胞进行不对称有丝分裂, 正常稳定状态下约半数子细胞仍保持干细胞的全部特性, 它是 LSC 最显著的特征之一。Hope 等7将带有示踪标记的人 LSC 植入NOD/SCID小鼠, 人 LSC能在全部小鼠骨髓内形成白血病细胞克隆, 继续取小鼠骨髓细胞进行连续传代移植, 移植 12 周后在第二代、甚至第三代受体骨髓内仍可见与原代相似的白血病克隆, 说明LSC 具有自我更新能力。那么维持 LSC 自我更新能力的分子机制是怎样的呢? 近年来研究证明Bmi-1 基因和 MLL基因在其中扮演着非常重要的角色。2.1 Bmi-1 基 因 Bmi-1 是 B 细 胞 特 性 的Moloney 小鼠白血病病毒整合位点 1 基因的简称,为 PcG(polycomb group)转录抑制因子家族的一员,常高表达于造血前体细胞, 是维持 HSC自我更新的必需因子。而 Bmi-1 等位基因剔除(Bmi- /-)小鼠的长期造血重建能力显著下降, 说明在维持正常造血中起着重要作用。为探讨 Bmi-1 是否同样参与调控 LSC的自我更新, Lessard等5将致癌基因Hoxa9 和 Meis1 导入 Bmi-1- /-小鼠胎肝细胞, 并移植到亚致死剂量照射的同系小鼠, 结果无论受体小鼠 Bmi- 1 基因的表达状态如何(Bmi-1+/+或 Bmi-1- /-), 在相同的时间内所有受体小鼠均能形成AML, 并具有相似的表型和病理特征, 但 Bmi-1- /-受体小鼠外周血白血病细胞较低, 其骨髓细胞不能使下一代受体小鼠发生白血病。若诱导 Bmi-1基因表达则能逆转 Bmi-1- /-小鼠来源 LSC 的致病能力。提示 Bmi-1 基因在白血病形成早期并不是必需因素, 但 Bmi-1 高表达却是维持 LSC 自我更新机制的关键。2.2 MLL 基 因 MLL 基 因 即 混 合 系 白 血 病(mixed lineage leukemia)基因, 其编码的 MLL 蛋白是维持正常造血所必需的转录调控因子。最近发现, MLL 相关融合基因在造血祖细胞重获自我更新潜能、并向白血病干细胞转化的过程中起着重要作用。Krivtsov等6利用鼠干细胞病毒载体将MLL-AF9 融合基因导入小鼠粒单祖细胞(GMP),这种 GMP 能够启动小鼠发生白血病, 提示 MLL-AF9 通过诱导 GMP 重获自我更新能力从而引发白血病。进一步利用基因芯片分析 MLL-AF9易位对GMP 细胞基因表达的影响, 发现 MLL-AF9 融合基因的表达将引起与自我更新相关的基因在GMP 重新激活, 如 HOXA和 Mef2c 基因的快速高表达。以上结果表明, MLL-AF9 融合基因的形成参与调控造血祖细胞向 LSC 的转化, MLL- AF9能够诱导造血祖细胞重新获得自我更新能力。3. LSC 的生存优势LSC 具有独特的生存优势。与 HSC 相似,95%以上的 LSC 处于细胞周期的静止期(G0期),因此大多数 LSC 处于休眠状态, 并不进行DNA的复制和完成细胞增殖活动。然而, 与 HSC 不同的是, LSC具有更强的增殖潜能以维持 LSC 的生存优势。根据对 Hoechst 33342 或 Pyronin Y 拒染的特点分离静止期的 LSC, 将其在无外来生长因子的条件下进行无血清培养 72 小时, 结果发现处于 G0 期的 LSC百分比大大减少(减少到约 16.7%),而大部分 LSC 进入 G1 或 S 期; 然而, 在相同的培养条件下仍有高达 98.3%的正常HSC 处于G0期, 提示 LSC 能够自发地进入细胞周期, 通过细胞无限增殖以保持 LSC的生存优势。Guan 等认为这其中可能有两方面因素的参与, 一方面 LSC 可自分泌 GM- SCF 等生长因子, 从而动员 G0 期的LSC 进入细胞增殖周期; 另一方面, LSC 中某些基因突变导致非生长因子依赖性的信号转导通路激活, 如酪氨酸激酶受体 FLT3 基因突变形成串联重复序列(ITD), 持续激活的 FLT3/ITD 可通过下游信号通路(STAT5)传送增殖信号以刺激细胞生存7。与处于增殖期的CD34+白 血病细胞相比,静止期CD34+白血病细胞表达高水平的抗凋亡蛋白BCL-2和 BCL- XL,从而赋予LSC更强的抗凋亡能力。4. LSC 的多重耐药特点体外实验发现, LSC 对多种化疗药物耐受或呈低反应性, 一方面与 LSC 自身的细胞周期特点有关, 大多数 LSC 处于静止期, 因此对临床上的细胞周期依赖性化疗药物(如 5- 氟尿嘧啶)不敏感,并对 IL- 3 等细胞生长因子的刺激应答性也较弱。另一方面, LSC 表面表达多种膜转运蛋白, 能够将 Hoechst 33342 等荧光染料以及多种化疗药物排出细胞外,其中ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)膜转运蛋白发挥了重要的药物外排作用。ABC膜转运蛋白超家族具有 ATP 依赖性药物排出功能, 主要包括乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白及多重药物抵抗蛋白(MRP)。BCRP 介导的耐药谱主要包括米托蒽醌、阿霉素等抗肿瘤药物。研究发现, 无论是 BCRP 的蛋白质含量和 mRNA 水平, BCRP 均优先表达于 CD34+CD38-白血病干细胞亚群, 使得 LSC 胞内米托蒽醌的药物浓度明显低于 CD34+CD38+细胞。然而, 抑制 BCRP 并不能完全逆转 LSC 对米托蒽醌的耐药, 利用 BCRP 抑制剂 KO143 逆转 BCRP 介导的 LSC 外排作用, 能使胞内米托蒽醌浓度有所增加, 但胞内药物浓度却远远低于仅表达 BCRP 的对照组乳腺癌 MCF- 7细胞株。这些研究结果提示, LSC 的耐药性与胞膜上 BCRP 高表达有关, 但同时也不排除其他耐药蛋白质的存在10。最近在多种血液肿瘤 CD34+细胞中发现有 P- 糖蛋白、MRP 和肺耐药蛋白(LRP)等耐药相关蛋白质不同程度的表达。与正常骨髓 CD34+细胞相似, AML和高危性 MDS来源的CD34+细胞表达一定水平的 MRP 和 LRP, 而 P-糖蛋白则在 AML 的表达高于高危性 MDS。因此,LSC 多重耐药性是多因素共同作用的结果, 既与多数 LSC 处于静止期有关, 也离不开白血病细胞表面多种耐药相关蛋白质的外排作用。3 LSCs分子调控机制LSCs的自我更新、多向分化和无限增殖能力，称之为LSCs的干细胞性(Stemness)。LSCs的干细胞性相关的信号通路由一套关键的基因调控p。31核因子(NF)一rBNFxB是具有抗凋亡活性的转录因子，在大多数造血系肿瘤和其他肿瘤组成性激活19】。利用流式细胞术分选出CD34+CD38。CDl23+表型的AML干细胞，以电泳迁移率法(EMSA)32P标记检测LSCs和正常CD34+HSC的核提取物中NFKB寡核苷酸序列，发现AML的LSCs中存在NF-xB的组成性激活，而在正常HSC中未见表达。32 P13KAkt信号通路P13KAkt信号通路对细胞生长、生存和凋亡等许多方面都非常关键。P13KAkt信号通路在AML细胞被持续激活3I，在移植了LSCs的NODSCID鼠中也上调，具有抗凋亡作用，对LSC的存活起了重要作用。Pten(Phosphatase and tensin homologue)是一种负性调节P13K通路的脂质磷酸酶，对维持正常造血至关重要4f。Yilmaz等纠把Pten缺失的骨髓细胞或纯化的HSC注射到经照射的小鼠，能成功移植并能产生各种谱系的血细胞，但是仅在注射HSC初期观察到这种情况。说明Pten缺失对HSC分化、生存无明显影响，而对维持其静止状态和自我更新至关重要【IS-16。而LSC的Pten缺失后，导致LSCs的产生并增殖。Pten缺失在正常HSC和LSCs中的相反效果为选择性杀伤LSCs提供了可能性。mTOR(Mammalian target of rapamyein)是PL3 K通路下游调节因子之一，通过底物p70S6激酶和4EBP1的磷酸化调控蛋白转运。Yilmaz叫用mTOR抑制剂Rapamycin处理Pten缺陷小鼠，发现Rapamycin不仅消除了LSCs，使小鼠维持健康，而且挽救了Pten缺陷导致的HSC衰竭。说明roTOR活性增高介导LSCs增殖和正常HSC的衰竭。36 LSCs壁龛(Leukemia stem cell niche)HSC和其特异性微环境(干细胞壁龛)的相互作用是维持HSC自我更新和分化能力的关键调控机制。干细胞niche有重要的功能，如提供增殖和抑制信号从而维持干细胞的静止性。当niche内缺乏膜结合型Kit配体时，HSC不能维持。基质金属蛋白酶9(MMP-9)可使膜结合型Kit配体切割为可溶性Kit配体，促使HSC从静止的位于骨内膜的niche内迁移到利于分化的、富含血管的niche内，以及促使HSC迁移到外周血。研究发现MMP-9表达水平在AML升高。和HSC相比，LSCs可能拥有更多激活的迁移机制，有可能是MMP增加了可溶性配体的浓度，使得白血病在niche外自我更新或扩增。因此靶向抑制MMP可能抑制LSCs的扩增、提高白血病治疗。4基于LSCs的靶向治疗研究LSCs是白血病发生、难治和复发的根源，只有清除LSCs才有可能根治白血病。基于LSCs的靶向治疗，是未来白血病治疗的方向。41抗CDl23的靶向治疗CDl23是CD34+CD38AMLLsCs的独特标记，仅表达于LSCs，不表达于正常HSC。特异性作用于CDl23的制剂，既可杀灭LSCs又不影响HSC。Lock等引利用NODSCID小鼠模型研究证明CDl23的抗体7G3能抑制AMLLSCs在骨髓微环境中归巢、定位和增殖，防止器官浸润。42针对特异性分子通路的靶向治疗421 抑制NF-kB信号通路：蛋白酶体抑制剂 MGl32、Parthenolide和TDZD-8等，均能抑制NF-kB的活性，选择性靶向作用于LSCs【l 9|。Guzman等旧研究发现MGl32通过抑制NF-kB激活和活化特异性P53调节基因选择性地诱导AMLLSCs凋亡，而HSC几乎不受影响。联合应用MGl32和表阿霉素，可见AML细胞伴随p53调控基因Bax、GADD45及p21讹眦坤上调。MGl32和表阿霉素预处理AML细胞(共4例样本)12 h后，将AML细胞植入NODSCID小鼠，只有2例移植成功，移植率明显降低(39-75)。如果预处理AML细胞18 h再移植，移植率进一步降低为0128。而经MGl32IDR联合处理的正常细胞移植不受影响。Parthenolide(PTL)是菊科植物的主要成分，被证实为NF-kB的强抑制剂，可显著诱导人类AML和急变期CML细胞凋亡，而对正常HSC无影响。其分子机制可能为抑制NFr：B激活、活化p53以及增加活性氧体系(ROS)21。但盯L的缺点是水溶性很差，药理学特性较低，限制了它的临床应用。Jordan等联合Kentucky大学的Crooks博士一起开发的PIL类似物DMATP(Dimethylaminoparthen01ide)是一种口服制剂，它的水溶性比PTL大1 000倍，口服生物利用度达70，在NODSCID小鼠移植模型和犬急性白血病模型中观察到良好的生物学活性。将DMATP与CD34+CD38-CDl23+AML干祖细胞、CD34+CD38-CML干祖细胞、CD34+CDIO-B-ALL干祖细胞体外培养，它可选择性杀灭髓系和淋巴系来源的LSC。DMATP处理的AML细胞，其体外克隆形成能力明显下降，并且DMATP可明显降低AML细胞移植到NODSCID小鼠的能力。DMATP有望作为靶向作用LSC的新型药物19,22。TZD-8复合物是糖原合成酶GSK-313(Glycogensynthase kinase-3 beta)的抑制剂，对髓系LSCs具有细胞毒作用，而对正常造血干细胞无影响。TDZD8通过引发膜完整性丢失、诱导氧化应激和抑制相关信号通路来介导细胞死亡【231。422作用于P13KAktmTOR信号通路：敲除Pten基因的小鼠会导致HSC过度增殖，HSC迁移到外周廊和脾脏的数量增加，导致骨髓增殖性疾病和白血病形成，用mTOR抑制剂rapamycin处理可以恢复HSC的正常发展，阻断突变小鼠白血病的形成4|。但在白血病形成前后使用rapamycin的效果不同。Yilmaz等列用rapamycin预先处理Pten缺陷小鼠6周，再将AML细胞移植到受照射的鼠体内，结果发现小鼠维持健康，未表现出白血病的迹象，而未经rapamyein处理的对照组鼠在移植后20到3l天内全部死亡。43 干扰微环境阻断LSC和骨髓微环境相互作用CIM4是一个跨膜糖蛋白，参与细胞的黏附和运输。对人AML和鼠CML模型研究发现，用单克隆抗体靶向CD44能抑制AMI、CMI。进展，诱导分化，干扰LSC和骨髓niche的相互作用。AML-LSC与CD44的单克隆抗体H90共培养后，LSC丧失在NODSCID小鼠增殖的能力。如果将H90加入NODSCID白血病模型，可以使植入的白血病负荷明显减少，在体内选择性的杀灭LSCs1。此外，白血病细胞上的受体CXCR4和骨髓微环境中的基质细胞衍生因子1(St