实验性短暂脑缺血发作磷脂水平的变化及养血清脑颗粒的....doc

实验性短暂脑缺血发作磷脂水平的变化及养血清脑颗粒的作用 牛建平1 薛萍2 伍期专1* 李丹1 姚存姗1 王燕华1 包鹤丘1 摘要：目的 研究短暂性脑缺血发作(TIA)对磷脂的影响以及中成药养血清脑颗粒的作用。 方法 尾静脉注射过氧化物并窒息建立小鼠TIA模型,灌胃喂食不同剂量养血清脑,诱发4次后隔日断头取脑测定血浆和脑组织中溶血磷脂酸(LPA)以及酸性、中性磷脂等的含量。结果 不给药组的评分为：0.969 0.790， 给予2g/kg体重养血清脑颗粒， 评分为：0.500 0.408（P0.05）。TIA小鼠血浆LPA比对照明显升高, 分别为：6.12 0.35和2.11 1.27。治疗可逆转这一变化。为：4.88 1.55。TIA小鼠脑组织酸性磷脂与对照相比明显降低。分别为：2.27 1.13 及6.58 2.77mole/g 治疗组小鼠可上升至4.26 1.99mole/g。结论 实验性TIA小鼠出现血浆和脑组织中LPA及其它磷脂水平异常。养血清脑有逆转作用，可能用于缺血性脑卒中的治疗。 关键词 养血清脑颗粒 短暂性脑缺血发作 磷脂Changes of Phospholipids in Experimental Transient Ischemic Attack and the Effect of YangXuiQingNau (Jianping Niu, Ping Xue, Qizhuan Wu，Dan Li, Zunshan Yao, Yanhua Wang, Heqiou Bao) Abstract: Objective To study the effectiveness and mechanism of YangXuiQingNau in treatment for TIA. Methods Transient Ischemic Attack (TIA) was induced by injection_作者单位1北京大学第一医院神经内科1000342铁道部北京铁路总医院干部医疗科* 通信作者100034 北京西什库大街8号 北大医院神经生化研究室 of peroxide in mice. Different doses of YangXuiQingNau were feed every day. Lysophosphatidic acid , neutral and acidic phospholipid of both brain and plasma were assayed. Results The stroke score of mice feed with YangXuiQingNau(2g/kg body weight) was 0.500 0.408, while the score of control was 0.969 0.790 (p0.05). Plasma LPA and neutral phospholipid of mice with TIA were increased compared with health controls. These were 6.12 0.35 and 2.11 1.27. Administration of YangXuiQingNaudecreased it to 4.88 1.55. The acidic phospholipid of brain tissue decrease in TIA mice. YangXuiQingNau also partly reverse the decrement. These were 2.27 1.13 , 6.58 2.77mole/g and 4.26 1.99mole/g respectively. Conclusion Phospholipid level changes in mice with experimental TIA. YangXuiQingNau has beneficial effect on them. It may be used in patients with TIA. 近年来的研究表明：磷脂(溶血磷脂等)异常在心脑卒中的发生中起着重要的作用1，2。但是，目前对于短暂性脑缺血发作磷脂水平变化的实验研究还比较缺乏。而且临床上一些有TIA样症状的病人，治疗后症状不易恢复，溶血磷脂水平也降低很慢。中成药养血清脑颗粒有治疗偏头痛的作用， 但对其机制还不完全清楚。偏头痛与血小板被激活、5-羟色胺的释放有关。 溶血磷脂酸也可在血小板被激活时释放3,4。 因此，是否养血清脑颗粒可能对血小板激活有抑制作用，并进而抑制溶血磷脂的释放? 本研究以TIA动物模型，观察养血清脑对TIA样发作的作用，以及对溶血磷脂酸和其它磷脂的影响。 材料与方法1材料 叔丁基氢过氧化物，购自上海试剂一厂。溶血磷脂酸测定套试剂、定磷套试剂购自北京泰福仕科技开发公司。养血清脑颗粒购自天津天士力公司。2动物与分组 昆明鼠共八十只, 雌雄不限, 体重为18-22克,购自中国科学院动物研究所.动物均为北京市动物管理委员会颁布许可证的2 级小鼠。随机分成5组,即正常对照组,实验对照组,剂量1组,剂量2组,剂量3组,每组16只小鼠.13动物模型的建立 参考伍期专等建立的小鼠TIA模型5。0.11mole/L 过氧化叔丁醇t-BHP， 尾静脉注射(1ml/100g体重)10分钟后，置于约0.3L容器中窒息10分钟, 观察体征。神经系统评分参见文献6。4实验方法 于小鼠第一次TIA诱发后，通过食管给实验对照组、剂量1组、剂量2组、剂量3组喂食蒸馏水、1.0g/公斤体重 养血清脑、2.0g/公斤体重 养血清脑、4.0g/公斤体重养血清脑。连续喂药3天为一个周期。一共四个周期。 于第4次诱发的第二天断头取血取脑。实验期间， 每天进行一次评分。15磷脂的测定 血浆溶血磷脂酸测定：参见试剂说明书。取全血，置于抗凝管中。 4000g离心10分钟，吸上清，抽提磷脂成分、浓缩、分离。最后显色。于90C水浴放置5分钟，取出于室温放置35分钟后测定。脑组织的测定与以上相似，匀浆后直接提取磷脂成分。总中性磷脂分析：标本用氯仿/甲醇提取，高氯酸消化，用定磷试剂测定。酸性磷脂的测定：在样本用氯仿/甲醇提取后酸化。其余同中性磷脂。15统计方法 SPSS统计软件8.0。多组间比较用方差分析。 结果1 磷脂水平的变化及与养血清脑剂量的关系 1. 1养血清脑对溶血磷脂酸水平的影响 TIA样发作小鼠脑组织LPA水平与正常对照相比轻度增高，但差异不明显。较大剂量的养血清脑冲剂(4g/kg体重)增高脑组织LPA水平。TIA样发作小鼠血浆LPA水平与正常对照相比有较大程度增高。较大剂量养血清脑(4g/kg体重)使其降低。见表1。 表1 养血清脑对溶血磷脂酸水平的影响_ n 脑LPA(nmole/g 脑组织) 血浆LPA(mole/L)_正常对照组 16 152.9 108.4 2.11 1.27剂量3组 16 163.1 78.5 4.88 1.55剂量2组 16 168.8 107.6 7.69 1.09 剂量1组 16 180.9 87.8 6.22 0.30 不给药组(实验对照) 16 178.4 135.5 6.12 0.35*_注：剂量1组给药为：1.0g/kg 体重、剂量2组：2.0g/kg 体重、剂量3组：4.0g/kg 体重。经方差分析，血浆LPA的F值=8.092，p值=0.021。组间有显差异。组内相比：不给药组与正常对照组的差异有显著性(p0.05)。 1. 2 其它磷脂水平的改变 TIA样发作小鼠所测的总中性磷脂、酸性磷脂等均有所改变。对于脑组织，TIA发作可使中性磷脂增高而酸性磷脂下降。 而血浆表现出复杂的变化特点，它与脑组织的变化并不完全呈平行关系。养血清脑冲剂对TIA样发作小鼠的这种变化也有影响， 而且与剂量有关。适当剂量的养血清脑可以使磷脂水平趋向正常。详见表2。 表2 不同剂量养血清脑对磷脂水平的影响 n= 中性磷脂 酸性磷脂 _ _ 脑组织(mole/g ) 血浆(mole/L) 脑组织(mole/g ) 血浆(mole/L)正常对照组 16 26.9910.31 1130680 6.582.77 22579剂量3组 16 65.2330.98 45302240 4.261.99 370113剂量2组 16 69.0431.22 32801800 3.551.27 37098 剂量1组 16 76.3934.78 32001680 2.661.22 34535不给药组 16 78.9736.50* 41802080 2.271.13* 42085 注：剂量分组与表1相同。经方差分析，脑组织中性磷脂的F值=7.741，p值=0.000，组间差异明显大于组内差异 ; 酸性磷脂F值=7.289，p值=0.000。组间差异也明显大于组内差异。 2. TIA小鼠的体征及养血清脑的作用2. 1养血清脑明显减轻小鼠TIA样发作的体征。 养血清脑对小鼠TIA样发作有减轻作用和促进恢复作用。表现为卒中评分下降。这一作用与剂量有关。 小剂量（1.0g/kg 体重）作用不明显。剂量2与剂量3的作用相差不多。经方并差分析剂量2组与不给药组差异显著。(p0.05)见表3。 表3 不同剂量养血清脑对TIA小鼠发作的影响_ n 神经系统评分 _正常对照组 16 0 剂量2组 16 0.500 0.408 * 剂量3组 16 0.562 0.461 剂量1组 16 0.812 0.783 不给药组(实验对照) 16 0.969 0.790 _注：诱发后第二天评分，本表为四次诱发评分的平均值。剂量分组与表1相同。F=6.779 P=0.00。两组间比较：”*”表示与实验对照组差异p 0.05。 2. 2 不同剂量养血清脑在不同诱发阶段的作用 不同剂量的养血清脑在四次诱发的各个阶段的作用如图1 所示。对于第1、2、4次诱发，养血清脑均有减轻体征的作用。小剂量的效果不如较大剂量明显。23 TIA体征随诱发次数增加的变化小鼠的体征随着诱发次数的增加有加重趋势， 表现为评分值的增加。其中第四次评分与其它几次评分值有显著差异。见图2。它提示：经过4 次诱发TIA， 小鼠可能产生了不可逆变化。3. 讨论 血小板激活与血栓形成过程中的活性物质很多都是脂类(包括磷脂)或与脂类有关的物质。最近的研究还发现溶血磷脂酸(LPA)等也与血栓形成过程有关。当血小板被激活时可释放LPA。它可以刺激血小板聚集和平滑肌收缩,并促进血管内皮细胞增殖7。目前， 关于在脑缺血时血浆和脑组织LPA含量的变化及药物对其干预的报道很少。本研究结果表明：与正常对照组相比，TIA发作小鼠不但溶血磷脂酸明显增高，酸性磷脂和中性磷脂都有明显的改变。血浆中的变化也有类似趋势， 但不如脑组织明显。已有的研究表明： 溶血磷脂酸在凝血和形成血栓的时候增高2,4。但是，为什么中性和酸性磷脂会发生这样的变化还不清楚。可能与神经细胞膜受损伤有关。 据报道养血清脑颗粒具有疏通血脉、活血化瘀和平肝止痛的效果。从本研究结果看来，它对于实验性小鼠TIA发作有良好的作用。 一方面它可以明显减轻TIA小鼠的体征， 使卒中评分明显降低。另一方面， 它对于由TIA 发作导致的脑及血浆溶血磷脂酸及中性和酸性磷脂异常有纠正作用。由于这些异常是由于TIA或过氧化物导致的脑损伤所造成的， 因此本研究表明，作为一种镇痛的中药制剂，它的作用可能不是单一的抑制与痛疼相关的神经递质，如5-羟色胺， 而可能有更广泛的作用和更加复杂的机制。已经知道溶血磷脂酸在凝血和血栓形成时释放，同时又可以作用于血小板引起一系列效应8,9。从本研究结果看， 由于脑组织的溶血磷脂酸也明显增高， 因此不能认为LPA完全是由被激活的血小板释放所致。很可能在TIA的继发性脑损伤中，或脑组织受到活性氧应激压力时， 也会产生溶血磷脂酸。 而养血清脑颗粒对此也有保护作用的。从目前研究结果看， 还不知道养血清脑颗粒的治疗作用主要的通过其抗自由基的作用，还是通过抑制血栓形成以及继发性脑损伤。由于养血清脑颗粒有着良好的作用， 因此它在临床上可能有着较好的应用前景。参阅文献：(1) Siess W, Zangl KJ, Essler M, et al. Lysophosphatidic acid mediates the rapid activation of platelets and endothelial cells by mildly oxidized low density lipoprotein and accumulates in human atherosclerotic lesions. Proc Natl Acad Sci 1999 96(12):6931-6(2)伍期专，孙玉衡， 黄世昌等 缺血性脑卒中血浆溶血磷脂酸的研究。北京大学学报(医学版)， 2001， 33(4)：361。(3) Eichholtz T，Jalink K，Fahrenfort I，et al. The bioactive phospholipid lysophosphatidic acid is released from activated platelets. Biochem J. 1993, 291 ( Pt 3): 677-80(4) Gerrard JM, Robinson P. Identification of the molecular species of lysophosphatidic acid produced when platelets are stimulated by thrombin. Biochim-Biophys-Acta. 1989, 1001(3): 282-5 (5) 伍期专, 王润英, 包鹤丘, 小鼠短暂性脑供血不全样发作的实验模型. 基础医学与临床, 1995, 15(3):222.(6)Ohno K, Ito U and Inaba Y. Regional cerebral blood flow and stroke index after left carotid artery ligation in the conscious gerbil. Brain Res. 1984, 297:151-7.(7) Moolenaar WH. Lysophosphatidic acid,a multifunctional phospholipid messenger. 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