猕猴桃抗病抗逆新品种选育及传统产业改造升级技术集成研究科技报告

目录引言11猕猴桃抗病抗逆新品种选育21.1技术背景21.2抗病抗逆新品种选育过程21.3新品种分子鉴定41.4主要性状分析42传统猕猴桃基地改造升级研究62.1 土肥水管理62.2搭架改造 72.3整形修剪72.4花果管理 82.5雌雄互接92.6 采收 93结论10参考文献119图表清单图1 “XXX”号等5个品种的相似系数比较4图2 “XXX”号猕猴桃果实外观及横切面图5图3传统猕猴桃基地改造前图片10图4传统猕猴桃基地改造后图片10表1XXX号和XXX号果实特性比较 6表2不同温度条件下XXX号果实好果率比较6引言猕猴桃又名“奇异果”、“长寿果”、“美容果”，属呼吸（高峰）跃变型浆果类木质藤本植物。因其在世界上消费量最大的前26种水果中营养最为丰富全面，而享有“水果之王”、“世界珍果”之美誉，是世界各国尤其是发达国家竞相发展的新型保健果品。近20年来，XX县猕猴桃产业得以快速发展，栽培面积11万亩、总产量11万吨、总产值3.1亿元，现已成为继柑橘、烟叶之后的第三大农业支柱产业。长期以来，猕猴桃种植户生产管理仅凭传统经验，猕猴桃生产管理差，产量低，品质差，加上近年来，猕猴桃病虫害高发，稍有不慎就会造成减产减收，挫伤种植户的积极性。由于传统品种有所退化，品质参差不齐，市场价格时高时低，品牌战略难以推进，规模效益很难实现。因此，为规范猕猴桃产业健康发展，实现规模效益和品牌效益，加强猕猴桃抗病抗逆新品种选育，对猕猴桃传统产业改造升级刻不容缓。1猕猴桃抗病抗逆新品种选育11技术背景猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实，研究发现：乙烯对于猕猴桃等呼吸跃变型果实的成熟具有举足轻重的作用，通过控制猕猴桃果实内乙烯的生成可有效延长猕猴桃贮存的时间。在乙烯生物合成的过程中，有三个酶起着相当重要的作用，分别为：腺苷蛋氨酸合成酶（SAMsynthetase,SAMS)、ACC合成酶（ACCsynthase,ACS)、ACC氧化酶(ACCoxidase,ACO)，其中ACO在乙烯生物合成过程中特别关键，通过调控ACO基因及其表达，就可以很好的控制果实内源乙烯的合成，从而达到延长果实贮藏时间的目的。大多数采用转基因方法获得的耐贮猕猴桃新品种均带有筛选标记，随着转基因植物研究的深入和转基因作物的大规模产业化，转基因植物的安全性越来越受到人们的重视，带有筛选标记的转基因植物品种由于潜在的各种安全性问题，特别是由于抗生素筛选标记引发的转基因食品安全性问题，目前无法通过国家审查。因此，开发获得无筛选标记的耐贮猕猴桃转基因植株，对于耐贮猕猴桃新品种的选育和转基因植物安全都具有重要意义。12抗病抗逆新品种选育过程近年来，我公司依托XX大学和XXX院的技术力量和精准扶贫帮扶对接优势，在我公司基地内开展了“XXX号”猕猴桃新品种选育试验。本方法的特点是将选择标记基因和目的功能基因分别构建到一个双元表达载体的两段不同T_DNA上，经农杆菌介导的遗传转化将目的基因和选择标记基因整合到同一染色体的不同部位，通过后代的筛选，获得无选择标记的转基因植株。该方法获得的耐贮猕猴桃品种安全性高，易于通过国家农业部审查。具体方法为：（1）ACO基因的获得。从猕猴桃叶片中提取RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后通过设计引物获得ACO基因。（2）将ACO基因反向连接入双右边界双元载体，将载体转化入农杆菌中，通过叶盘转化法导入愈伤组织中，再通过筛选培养基获得抗性愈伤组织，经过分化培养基培养获得含有筛选标记再生苗。双右边界双元载体是指载体有一条左边界和两条右边界，其中标记基因在左边界和第一条右边界链接，目的基因是在第一条右边界和第二条右边界之间。（3）上游引物为TermF:5-GGT,GCT,TTC,CCA,GTC,CAA,ATC,GTT-3，下游引物为TermR:5-CCA,GGT,TTA,GTC,GTC,TCG,TGT,CTG,GT-3，进行PCR扩增，80105预变性310min后运行下循环，9435s，5935s，7240s，共35个循环，最后7210min，2530s，取PCR产物530L进行0.6%1.5琼脂糖凝胶电泳分离获得阳性植株（含有目的基因的植株，575bp）。（4）通过遗传分离获得无筛选标记的含有目的基因的植株，将同时含有hpt基因和aco基因的共转化植株转移至温室栽培，随机挑选其中1050个T0代植株进行自交产生T1代后对T1代植株的基因组DNA进行PCR检测，从而获得无筛选标记的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即为新的耐贮猕猴桃品种。 13新品种分子鉴定采用荧光AFLP分子标记对“XXX”、“XXX号”、“米良”、“湘吉”、“翠香”开展亲缓缘关系分析。共选择8对荧光标记引物进行AFLP扩增，采用ABI377测序仪进行AFLP多态性检测分析。根据扩增片段的有无将其分别记为0和1，每个多态性片段分别代表一个基因位点。用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用 SimQual程序求DICE相似系数矩阵。用SHAN程序中的不加权成对算术平均法进行聚类分析，并通过Treeplot模块生成聚类图，对5个以上品种进行聚类分析，结果见图1。图中可见，“XXX”“XXX号”与相似系数最高。分子标记结果证明“XXX”和其他 品种不同，但又与母本“XXX号”接近。 图1 “米 良2”号等5个品种的相似系数比较14主要性状分析14.1植物学特性XXX号猕猴桃品种果实圆柱形，相比XXX号猕猴桃果型稍长，果型较之稍小，平均单果重50-70g，最大单果重110g。果皮为棕褐色，密被硬而长的褐色茸毛，果实横断面椭圆形，中轴胎座小、呈扁圆形。种子较多，棕黄色，每果平均种子678粒，千粒重1.78克。果肉黄绿色，汁液多，酸甜适度，具有清香味，同时该果实具有良好的耐贮性。植株长势旺盛，一年生枝灰褐色，被浅褐色茸毛，皮孔较稀、大。叶片近圆形，颜色浓绿有光泽。嫩叶黄绿或浅红色，叶缘有芒状针刺，主侧脉明显凸起。花单生或序花，冠径5.5-6.1厘米，柱头数37枚左右，雄蕊151枚左右已退化，属单性花。XXX号抗病虫能力强，无论在野生状态下还是在人工栽培条件下，均很少发现病虫的侵害。 图2 “XXX”号猕猴桃果实外观及横切面图 14.2经济学特性果肉绿色，肉质细密，细嫩多汁，风味浓甜，品质上等。可溶性固形物含量15%-185%，最高可达198%，维生素C930-1430g/g。XXX号猕猴桃在高、低海拔地区均能正常生长与结果，生态适应性良好，且丰产、稳产，果实品质优良，抗高温干旱能力强，耐储藏，具有较强的抗病虫能力，更适宜于在海拔较高(1000-1500m)的地区种植。市场价格，鲜果销售价格在每公斤8元左右，目前产品远销北京、上海、广东等经济发达省份。品种Cultivar果形Fruit shape外果皮颜色Exocarp color内果皮颜色Exocarp colorw可溶性固形物Soluble solidsConlent/%w总糖Total suagarConlent/%w有机酸Acid content/%W（维生素C）Vitamin C content/(mgkg)XXX号椭圆形棕褐色深绿色1518.58.514.70.70.99001530XXX号长椭圆形浅棕褐色绿色14.5177.8121.01.58001425表1 XXX号和XXX号果实特性比较 贮藏温度Storage temperature/入库42dStorage for 42days入库82 dStorage for 82 daye入库122 dStorage for 122 daye入库162 dStorage for 162 daye入库202 dStorage for 202 daye1-299.610.72a99.241.03a97.892.11a89.629.40a73.1216.03a3-498.611.40a94.733.80a77.7113.80b63.6225.03b22.7231.72b6-896.601.98b89.247.91b35.3720.08c27.0021.51c19.6517.03c注：所有处理均为采后第二天入库，冷库空气温度均为（952）%。小写字母表示0.05水平显著差异。表2 不同温度条件下XXX号果实好果率比较2传统猕猴桃基地改造升级研究2.1 土肥水管理2.1.1 土壤管理首先要进行深翻改土，深度一般为30-40 cm，然后再施有机肥，可促使根系大量生长，增强贮藏养分的能力。其次是要搞好果园耕作，深度为20cm，有利于提高土壤透气性、提高土壤保水、保肥能力。改良土壤。在排水沟的两侧，开80厘米深，50厘米宽的沟，可切断部分侧根，然后，分层埋施猪牛粪，适量磷肥，数量以填实沟深的2/3为宜。2.1.2肥料管理在秋季结合深翻施有机肥，在树冠滴水处采取沟施、穴施、环状施或放射状等方法施肥，深宽40-50 cm，放射状施肥做到内浅外深，以免损伤大量根系，每株10公斤有机肥，配合施用磷、钾肥。2.1.3水分管理果树的花前、花后需水期是干旱季节，可通过引水保证花前、花后灌水，以提高座果率，促进果实膨大，进入夏季雨水较多，一般不需要灌水，对部分积水的果园要进行开沟排水。2.2搭架改造 果园水泥杆架东倒西歪,将斜歪倒的水泥杆架扶正,按行向调整桩柱，在桩柱上将断掉横向铁丝拉拢连接扭紧结实，行的两端埋设拉丝固定,架设好铁丝后用攀桩线拉牢。2.3整形修剪2.3.1整形。采用单主干上架，在主干接近架面的部位选留2个主蔓，分别沿中心铅丝伸展，在主蔓的两侧每隔30 cm左右选留1个强旺结果母枝与并与行向垂直固定在架面上。2.3.2修剪2.3.2.1休眠期修剪。12月下旬开始到第二年元月底结束。先选留距主蔓较近的健壮发育枝和结果枝，数量不足时再选留中庸枝作结果母枝，有较大空间时也可选留短枝补空。选留的结果母枝应在饱满芽处剪截。修剪后结果母枝应均匀分布在架面上，有效芽数保持在3035个/m2。2.3.2.2更新修剪：选留和培养结果母枝基部发出或直接着生在主蔓上的枝条作新的结果母枝，将原来的结果母枝在更新枝附近回缩或疏除。结果母枝每年至少更新二分之一。培养预备枝：选留着生在近主蔓处未留作结果母枝的枝条，应剪留23芽培养更新枝，其余枝条全部疏除。同时，剪除病虫枝、干枯枝，清除病僵果。生长期修剪, 抹芽,萌芽到生长前期，抹除主干、主蔓上着生位置不适和过密及剪锯口附近的萌芽、瘪芽，约每周进行一次。疏枝：显蕾后结果母枝相隔1520 cm保留1个结果枝，每平方米架面保留1012 个结果枝。及时疏除细弱枝、密生枝、双芽枝、病虫枝及不可利用的徒长枝。生长季节每2周检查疏除一次，除在接近主蔓的部位全树保留20个预备枝外。未结果的发育枝应尽早疏除。摘心 :对生长强旺的结果枝和发育枝在其顶端开始弯曲缠绕时轻摘心，其上发出的二次枝只保留1个，顶端开始缠绕时再次摘心。绑蔓：新梢长到3040 cm时开始绑蔓，使其均匀分布在架面上。2周拉绑一次。2.4花果管理 2.4.1.疏蕾：侧花蕾分离后2周开始疏蕾，先疏除结果枝上过密的衰弱结果枝，再疏除结果枝上的侧生花蕾、畸形花蕾及病虫危害的花蕾。强壮长结果枝留56个花蕾，中庸结果枝留34个，短果枝留12个。2.4.2授粉：人工授粉应对不良天气，采集当天初开、花粉未散的雄花，用其雄蕊在雌花柱头上涂抹，每朵可点授78朵。也可采集即将开放的雄花，在2528条件下干燥1216小时，收集散出的花粉于低温干燥处保存，当雌花开放时花粉稀释5倍，用人工或机械将花粉撒到雌花柱头上。2.4.3疏果：落花后1015天先疏果、侧果、畸形果、病虫果、碰伤果和扁平果。健壮果枝留34个果，中庸果枝留12个，短果枝留1个或不留，成龄园每平方米架面留果40个左右。2.5雌雄互接改树时，如果雌树生长发育不良，可采用雌雄互接的方法增加花粉量。在雌树上选择一个中心枝嫁接雄性枝，修剪时注意为雄性枝预留空间，促其正常生长。雄树修剪应在授粉完后就进行，将开过花的小枝剪除，留生长健壮、方位好的新梢，为下年的开花授粉做好准备。2.6 采收 果实成熟期前2周开始采收。选测的果实可溶性固形物含量达到6.5%时即可分期采收，可直接运往市场销售；用于中长期贮藏的果实在可溶性固形物达到77.5%后在分期分批采收。应选择无雨、无雾天气或待露水干后采收。采果用具必须洁净，采果人员应剪短指甲或带手套。采下的果实要轻放入专用采果袋、果篮，再集中转入周转箱。采下的果实应放置于阴凉处，预冷后及时入库。图3 传统猕猴桃基地改造前图片图4 传统猕猴桃基地改造后图片3结论本研究课题通过抗病抗逆猕猴桃新品种选育，将选择标记基因和目的功能基因分别构建到一个双元表达载体的两段不同T_DNA上，经农杆菌介导的遗传转化将目的基因和选择标记基因整合到同一染色体的不同部位，通过后代的筛选，获得无选择标记的转基因植株，该方法获得的耐贮猕猴桃品种安全性高，易于通过国家农业部审查，同时又特别适合武陵山片区果农种植，具体很强的抗病和抗逆能力。基于此种方法研究出来的新品种广泛应用于传统猕猴桃基地的改