进口农副产品的转基因检测.doc

分类号：密 级：TS201.7公开单位代码：学 号：08523113208523117432大连工业大 学专业硕士学位论文中文题目：进口农副产品转基因筛选与品系检测英文题目：Genetically modified ingredients and maizes detection of imported agricultural products专业领域：食品工程隶属学院：食品学院研究生：杨静指导教师：张公亮 副教授董伟峰 高级工程师2015年 5 月目录学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或其他机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学生签名： 杨静 关于硕士学位论文使用授权的说明论文题目： 进口农副产品转基因筛选与品系检测 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。是否保密（ 否 ），保密期至 年 月 日为止。学生签名： 杨静 导师签名： 张公亮 2015年 5 月 19 日摘 要 随着转基因作物的迅速发展，转基因产品已经迅速进入到人们的生活中。为了维护自己国家的安全，很多国家都对要求转基因食品中转基因成分能够有效地被检测出来。这进一步对检测机构提出了严格的要求，所以完善检验标准十分迫切。本试验应用两种不同的试剂盒对四种不同加工程度的转基因玉米进行提取，并用实时荧光仪7500和viia 7对玉米品系MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507、BT176、MON88017、Bt176的检出率进行了分析，接着比较实时荧光PCR和基因芯片的检出率。文章最后我们对几种具有代表性的待检样品进行了初筛和品系鉴定，实验结论如下：（1） 对于加工程度比较轻的产品或是未加工产品，采用TAKARA试剂盒提取后，基因芯片法检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11，MIR604、GA21、T25等外源基因，而实时荧光PCR反应并没有检出GA21、T25，基因芯片法的检出率比较高，宜采用基因芯片进行检测；（2） 精加工玉米产品可采用天根实际盒进行提取后，实时荧光仪7500和VIIA 7进行实时荧光PCR反应，和应用基因芯片法都检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604等外源品系，检出率相同；（3） 对于深加工产品玉米酒槽粕，采用天根实际盒在实时荧光仪7500上进行检测，检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604等外源品系，实时荧光PCR仪viia7和基因芯片法检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017等外源品系，实时荧光PCR仪7500的检出率更高； 本实验结合了实时荧光PCR和基因芯片技术对进口农副产品进行了检测分析，两种方法的检测结果准确、检测周期短、特异性强、灵敏度高，能够符合并满足日常检测的需要。可以用于加工食品中转基因玉米成分及品系的定性检测, 也可以作为常规PCR定性方法的确证试验方法。关键词：转基因；实时荧光PCR；基因芯片；定性检测VAbstract With the rapid development of transgenic crops, genetically modified products has rapidly into peoples lives.In order to safeguard the security of own country, many countries have requirement for genetically modified genetically modified foods can be effectively detected.This further testing organization made stringent requirements, it is very urgent to improve inspection standards. In this study , two different kits for four different levels of transgenic corn processing to extract ,and analyzed detection sensitivity with quantitative real-time PCR 7500 and viia 7 though strains of maize MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507、BT176、MON88017、Bt176, and then compare the detection rate between real-time PCR and gene chip . Finally, several representative samples were screened and strain identification, experimental results are as follows: (1) For the degree of processing relatively light products or unprocessed goods,with TAKARA extraction kit, the chip method detected Tc1507、 NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017、BT11、MIR604、GA21、 T25 substandard genes, and real-time PCR reaction did not detection of GA21、T25, gene chip method detection rate is relatively high, should be detected by gene chip； (2) For the refined corn products ,with tiangen extraction kit, real-time fluorescence analyzer 7500 and real-time fluorescence viia 7 and gene chip are detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017、 BT11、MIR604 substandard source strains, the detection rate is same;(3) For the corn deep processing corn wine scums ,with tiangen extraction kit ,real-time fluorescence analyzer 7500 detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、 MON88017、BT11、MIR604 substandard source strains, real-time fluorescence analyze viia7 and gene chips detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 substandard source line,7500 has a higher detection rate.This experiment was used a combination of real-time PCR and gene chip technology to analyze the import of agricultural products were tested, the two methods has accurately detect short cycle, specificity, high sensitivity, and can meet the needs of daily testing. This method can be used for the qualitative detection of transgenic corn processed food ingredients and strains but can also be used as a confirmatory test methods qualitative conventional PCR methods.Keywords:GMO；real-time PCR; gene chip; qualitative detection目 录目 录第一章 绪 论11.1研究背景11.1.1转基因发展概况11.1.2玉米、马铃薯转基因品系鉴定现状1 1.1.2.1转基因玉米品系鉴定现状1 1.1.2.2转基因马铃薯品系鉴定现状21.2 转基因植物提取方法概述21.2.1十六烷基三乙基澳化馁(CTAB)法21.2.2十二烷基磺酸钠(SDS)法31.2.3离心柱吸附提取DNA31.2.4磁珠法提取DNA31.2.5全自动核酸提取工作站41.3聚合酶链式反应(PCR)技术41.3.1定性PCR技术优势41.3.2 PCR方法分类5 1.3.2.1 普通PCR5 1.3.2.2 多重PCR5 1.3.2.3 实时荧光定量PCR技术5 1.3.2.3.1实时荧光定量PCR技术原理5 1.3.2.3.2实时荧光定量PCR技术应用6 1.3.2.4巢式PCR6 1.3.2.5 其他PCR方法71.4生物芯片技术71.4.1基因芯片技术81.4.1.1 基因芯片技术原理81.4.1.2基因芯片技术分类91.4.1.3基因芯片技术的发展现状91.4.1.4基因芯片技术的应用91.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用91.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用101.4.1.5 基因芯片存在问题与展望101.5 本实验研究的主要目的和意义11第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系122.1 实验材料122.2 实验仪器与试剂122.2.1 实验仪器122.2.2 实验试剂与耗材132.3 两种试剂盒的提取方法以及效率比较132.3.1 提取方法132.3.1.1 离心柱法（TIANGEN）132.3.1.2 离心柱法（TAKARA）142.3.2玉米样品DNA浓度的测定142.4 实时荧光PCR反应142.5结果与讨论162.5.1不同加工程度玉米DNA浓度测定结果162.5.2 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系182.5.2.1玉米颗粒6743的扩增效果分析182.5.2.2粉碎玉米粒7167的扩增效果分析192.5.2.3玉米粉6979扩增效果分析212.5.2.4玉米酒槽粕4504扩增效果分析222.6 本章小结24第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系253.1 基因芯片方法253.2 利用基因芯片筛选玉米中转基因品系的结果253.2.1玉米颗粒6743的芯片结果263.2.2粉碎玉米粒7167的芯片结果263.2.3 玉米粉6979的芯片结果273.2.4 玉米酒槽粕4504的芯片结果28 3.3 基因芯片法和实时荧光PCR反应检测结果对比293.4 本章小结30第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测以及品系鉴定314.1进口薯格中转基因成分的检测314.1.1实验方法314.1.2结果与讨论314.1.2.1 薯格中转基因成分的初筛314.1.2.2薯格中转基因品系检测结果324.2干酵母中转基因成分的测定以及品系鉴定334.2.1实验方法344.2.2结果与讨论344.2.2.1 干酵母中转基因成分的初筛344.2.2.2干酵母中转基因品系筛选结果35参考文献36致 谢39第一章 绪论第一章 绪 论1.1研究背景1.1.1转基因发展概况 转基因产品对我们来说已然不陌生，便是使用分子生物学技术把人们所需要的某些物种的基因转接到一些物种中去，向着人们所需要的性状发展。近年来转基因技术发展快速，在农作物生产利用方面相当广泛，主要用于防治虫害和提高农作物产量等方面，转基因大豆、棉花、玉米、大米等农作物无论是品质还是产量都得到了较大的改善。一方面，转基因作物的迅速发展也引起人们对转基因作物所带来的食品安全的关注，关于转基因食品是否安全地话题从未终止；另一方面，尽管转基因食品的安全性并没有得到确定性的验证，但是由于转基因食品的巨大利益和前景，全球大多数国家都根据不同的需要进口转基因作物1。就标识问题而言，雀巢公司作为世界最大的食品生产公司之一，在1999年到2009年期间，被检出很多食品具有转基因成分，包括婴儿纯米粉、甘脆朱古力、百福豆乳、凤仙雪条、百福豆腐花巢等，对此，中华人民共和国农业部农业回复: “国家对农业转基因生物实行标识制度”2，也就是说要进入中国国境的转基因食品，必须具有转基因标识; 没有标识或者是标识不符合规定的，禁止进口或销售。 上个世纪80年代，科学家以烟草为材料，成功地研制出了世界上第一个转基因作物，自此以后，转基因技术得到了迅速的发展。如今人们接触到产品很多都含有转基因成分，比如说大豆、水稻、马铃薯和棉花、西红柿等。目前我国转基因作物的进口量十分巨大，尤其是转基因大豆和玉米的进口。1.1.2玉米、马铃薯转基因品系鉴定现状1.1.2.1转基因玉米品系鉴定现状目前，依据我国农业部的最新公告：SN/T1196-2003玉米种转基因成分定性PCR检测方法中规定了对玉米Btl l、T14/T25、DAS59122、CBH351、MIR604、3272、GA21、 MON88017、Evebtl76、MON89034、MON810、NK603、TCl507、MON87460、MON863品系中转基因成分的定性检测3。伴着转基因的进一步发展，科学家将越来越多的重组DNA导入到农作物中，刘岩等4将脱氢酶基因gutD从大肠杆菌分离出来，并将其导入玉米中。Li等5从盐芥中获取了TsVP基因，并将其导入玉米基因组中。然而这些导入的片段很多都无法检测。因为转基因片段插入的随机和不可控性, 这就要求检验检疫人员尽最大努力的检测到所有外源基因, 让人们有选择和知情的权利。除了上述我国行业标准中有明确规定的转基因玉米品系, 欧盟标准中还有我国未批准的转基因玉米Btl0、Bt176、98140、LY038等品系，对于这些品系，我国并没有明确的公告及方法，检测的准确性也不高。1.1.2.2转基因马铃薯品系鉴定现状马铃薯(Solunum tuberosum)，高淀粉茄科作物，京杭收到害虫的侵袭，出于获得优良的植物品系，人们通过应用转基因技术获得高抗虫、高含量、高蛋白质的马铃薯品种 6。当前，商业化种植的转基因马铃薯分为两类，包括抗病毒和抗马铃薯甲虫两种7。重组马铃薯多选用tbcS座为启动子，NOS为终止子，NPTII作为荧光筛选基因。1.2 转基因植物提取方法概述随着植物转基因技术的广泛开展，全世界的学者们建立了多种植物DNA提取方法8。总结这些方法，我们发现这些DNA的提取方法原则上基本相同，主要机理都是通过破碎细胞，获得DNA，去除蛋白质、多糖等杂质，最后分离提纯DNA等一系列步骤。在DNA提取过程中，蛋白质、多糖及次生代谢产物，这些植物中固有的成分影响DNA的提取纯度；而且细胞内多酚的存在可能会降解植物DNA，降低限制性内切酶、DNA聚合酶及DNA连接酶等的生物活性，对后续的检测必然造成影响9.10。十二烷基磺酸钠(SDS)法和十六烷基三乙基澳化胺(CTAB)法、DNA提取试剂盒法、磁珠吸附法是现前经常使用的提取DNA的方法11 。1.2.1十六烷基三乙基澳化馁(CTAB)法CTAB，在高盐的情况下与DNA结合形成结合物，该复合物可溶解、存在稳定;低盐溶液中，该复合物形成沉淀。接着加入有机溶剂将蛋白质和核酸进行分离，加入RNA酶去除RNA，用异丙醇沉淀DNA ，最后用适宜浓度的乙醇进行漂洗。目前，在根据传统CTAB方法的原理上，人们为了满足不同的实验需要，大多对传统的CTAB法在不同程度上进行了改良。李艺等12 利用CTAB法提取出玉米基因组DNA，通过电泳显示扩增目标条带分明,基本上可以满足SSR-PCR检测的需求。魏琦超等13阴利用改良CTAB法成功的提取小麦干种子总DNA，结果证实该法提取的DNA产率好、质量高，完全满足分子生物学下游实验的要求。李金路等14以10种植物为基础，在传统CTAB的方法上进行改良，结果表明改良后的方法得到的DNA纯度高，PCR的效果也比较好。1.2.2十二烷基磺酸钠(SDS)法 十二烷基磺酸钠(SDS)，在高温的条件下,SDS可以高效破裂细胞膜，和多糖、蛋白质结合，过滤后就能除去这些杂质;接着为了除去RNA，加入RNA酶;再加入中性溶液提高盐浓度，使SDS一蛋白质复合物的溶解度变得更低，使沉淀更加完全，去沉淀，留上清；最后使用有机溶剂抽提DNA，无水乙醇沉淀和漂洗DNA。现在，因为应用传统的SDS法，过程繁琐，且DNA效率低，所以现在大多数实验室并不用传统的SDS方法进行提取。吴则东等15采用改良后的SDS法提取甜菜干中的DNA，再采用1%琼脂糖进行电泳，其结果为：SDS法提取的DNA纯度高，电泳后的条带比较清晰，能够满足下游分子生物学技术的要求。 1.2.3离心柱吸附提取DNA DNA提取试剂盒快速，能够在两个小时内进行快速提取，其原理在高盐溶液中，是因为离心吸附柱能够和植物体内的脱氧核糖核酸特异性结合，加入漂洗液进行漂洗、溶解蛋白质、糖类等物质，离心，去除漂洗液；最后在低离子浓度下，用TE洗脱并保存植物组DNA。目前市场上有很多种针对不同植物材料的DNA提取试剂盒，针对这些试剂盒，鲜有相关报道分析、比较不同试剂盒的DNA提取效率、能否能够满足后续分子生物学实验的需求 。1.2.4磁珠法提取DNA 磁珠法的提取原理和硅胶膜离心柱法有些相似，它是通过在提取过程中加入纳米级磁珠微珠，其表面含有一种能结合核酸的官能团。目前市场上常用的磁珠微珠分为两类，即硅磁、离心磁珠。其原理是在磁场的作用下，植物组细胞破碎，核酸和磁珠结合，分离出了多糖、蛋白质，然后用TE洗脱核酸，最后在磁场作用下回收磁珠，这种方法得到的DNA纯度高、得率高。R Caldarelli-Stefano等16采用离心磁珠法对石蜡组织中的DNA进行提取，与传统DNA提取方法相比，省时省力。但是磁珠法由于造价昂贵，在某些大型企业或者政府机构的实验室才有能力购买，在日常的检验分析中并不常见。1.2.5全自动核酸提取工作站DNA提取自动化工作站分为几个部分，通过将不同模块的功能整合在一起，实现核酸的大同量提取以及高度自动化。与其他方法相比，全自动核酸提取工作站有以下优势:程序自动化;操作程序化，功能比较强大;能够有效地避免各种操作污染;能在过程中进行实时监控，准确监测污染;枪头定位系统比较准确，液体传输功能强大;整合了各种仪器和试剂，试剂开放17。但是目前全自动核酸提取工作站由于价格昂贵及其适合大量提取的特点，在医学提取血液DNA较常见，在日常食品分析检测中并不常用。1.3聚合酶链式反应(PCR)技术聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，其原理是模拟生物体内的DNA双链的复制，在一定的条件下进行体外DNA片段扩增的过程，因为人工合成的引物不同而具有特异性。生物的DNA是一个双螺旋结构，它有两条反向平行的多核苷酸链，这两条链有着同样的中心轴，双链上的碱基序列互补。PCR反应原理是半保留机制，主要反应步骤有变性、退火、复性等三个阶段。在体外扩增的过程当中，当体系温度升到一定温度时，DNA双链变性，解旋变为两条单链，接着随着体系温度的下降，反应引物与单链的某一端结合形成DNA单链复合物。在TaqDNA聚合酶的催化作用下，该复合物以DNA双链中的一条单链为模板，以dNTP(脱氧核苷三磷酸)为原料，连续的合成新的DNA单链，这就是PCR的过程。目前“PCR”技术作为分子生物学中一种成熟的技术，在生物教材中频频出现。1.3.1定性PCR技术优势PCR扩增，也就是放大，它可将极少的目的基因迅速复制，可以达到原量的数十万倍甚至数千百万倍，不需要通过琐碎的流程，便可获得大量的精确DNA拷贝18。插入到转基因产品中的外源基因可分为三个部分：标记基因、调控基因和目的基因，调控基因又由启动子和终止子组成。 PCR的基本反应体系可以概括为五要素:模板、一对寡核昔酸引物、耐热DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核糖核昔酸、反应缓冲液等。1.3.2 PCR方法分类1.3.2.1 普通PCR 普通PCR方法在过去几年里，是常用的转基因检测方法，早在2000年初始，就成为出入境检验检疫系统的常用方法。陈颖等19等选用了五种常见大豆制品，用试剂盒(Kit)法和CTAB法对其中的DNA进行了提取，分析不同方法的内源基因Lectin的扩增效果，结果证明了试剂盒提取的效率较好。王小花等20建立一种用于检测的转基因成分的普通PCR技术，该方法选用了大豆转基因标准品为材料，设计了针对内标记lectin、35S启动子和CP4-EPSPS的引物。1.3.2.2 多重PCR多重PCR(Multiplex PCR，MPCR)是在单一PCR的基础上，加入多个引物到一个反应中就能检测到多个目标基因的一种方法。王媛等21以大豆内源基因 Lectin、3 5S启动子、Nos终止子和筛选基因Epsps为检测对象，优化反应体系中各引物的量，并且筛选出PCR扩增过程中的最佳退火温度，提供了一种应用多重PCR检测大豆中转基因成分的方法。邵碧莹等22选用CTAB法提取不同大豆制品的总DNA，设计特异性引物进行二重PCR，最终检测到7个样品具有转基因的存在。陈贞等23 设计了6对引物检测棉花中的转基因成分，这些引物能扩增适合的基因片段，通过优化PCR扩增体系中不同引物终浓度和退火温度对多重PCR检测的影响，提供了一种应用6重PCR检测棉花中转基因成分的方法，结果表明:该6重PCR方法检测精度极高。1.3.2.3 实时荧光定量PCR技术 随着转基因作物的大量种植，现在对转基因产品的检测要求越来越高，由于普通PCR只能对转基因成分进行定性分析，并且还需要进行凝胶电泳，不能满足日益发展的对转基因成分含量的测定，因此，根据实际检测的需要，经过一系列实验探讨，定量PCR检测技术应势而出。目前，常用的定量方法可以分为以下几类：竞争性定量PCR、内/外参照定量PCR和实时荧光定量PCR，在几种定量方法中荧光定量PCR是实验检测中最常用的一种方法，实时荧光定量PCR反应步骤简单，能够有效降低PCR实验过程当中的污染问题。1.3.2.3.1实时荧光定量PCR技术原理 实时荧光定量PCR，是在反应体系中加入荧光物质，通过荧光物质发出的信号进行实时监测，然后通过标准曲线的计算公式，计算出未知植物组DNA的初始浓度，完成了DNA的实时检测。实时荧光定量PCR分为两类：染料类和探针类，染料类是通过和双链DNA空间结构相结合，通过判断发光的特征来估算扩增的模板浓度;探针类的原理是探针能够特异性结合DNA序列，主要有Taqman探针、分子信标探针和杂交探针。当前Taqman探针的使用最为普遍。Taqman探针法是在普通PCR的一对引物外，增添一条两头带有荧光标识的特异的寡核昔酸探针，此探针5端标记荧光报告基团，3端标记淬灭荧光基团，最常用的荧光基团有FAM和VIC两种，这些基团结合到5端，发出的荧光可以被临近的3端淬灭基团吸收。当探针没有被破坏时，淬灭基团将荧光基团发出的荧光吸收掉，因此荧光信号就不能被检测到。在PCR扩增的过程中，在Taq聚合酶的作用下，DNA单链伴随着模板的延伸而逐渐移动，当移到探针的连接位置，外切酶开始发挥活性，切断标记探针，这样荧光基团发出的信号就不能被淬灭，可以发出荧光信号。1.3.2.3.2实时荧光定量PCR技术应用实时荧光定量PCR技术具有普通PCR所没有的优点，目前在基因工程、临床医疗等领域已经被广泛应用24。在转基因研究领域，白卫滨等25研究了亚洲、欧洲、美洲等三大洲的转基因大豆粉标准品，并根据这些大豆的特性设计了一种引物和探针，成功的建立了一种检测豆粉中转基因成分的方法，灵敏度可以达到0.001%。Yoichiro等26提出了一种实时荧光PCR方法，该方法能定量检测农作物中的转基因成分，并证明该方法的重现性和重复性较好，为5.0%和15.9%；转基因玉米品系GA21, Event176和Roundup Readysoy检测限0.10 %。陈颖等27采用分子生物学相关技术 ，针对转基因玉米品系Event 176、Mon810以及玉米的内源基因Invertase的序列，设计了能特异性结合这些基因的引物探针 ，建立了一种定量检测转基因玉米品系Mon 810和Event 176的方法，该方法的检测灵敏度小于 0 .0 1%，其反应灵敏度远远高于国际上的要求。朱文斯等28利用实时荧光PCR技术，定性检测了不同农作物的加工产品：玉米、棉花、大豆、马铃薯、水稻中的转基因成分，认为实时荧光PCR技术快速、灵敏、准确，是一种可以被采用的实用检测并且鉴定植物中转基因成分的方法。 1.3.2.4巢式PCR巢式PCR (Nested PCR)属于变异的PCR，其原理是在反应体系中加入两对引物，同时进行PCR反应。第一轮扩增在外阴物的引导下进行PCR反应，结束后，其PCR产物将作为第二轮扩增的模板，在另一对引物的存在下进行第二轮的扩增。而半巢式PCR (Semi-nested PCR) 是在巢式PCR的基础上发展起来的，它是利用一对半引物同时进行PCR的反应。深加工产品破坏了植物细胞内的DNA分子，半巢式PCR可以解决被破坏样品难以检测含有转基因成分的问题。闻伟刚等29依据转基因大米的Cry1A(b) / Cry1A(c)基因和大米内源基因SPS，总共设计了6对半巢式PCR引物，扩增结果显示，半巢式PCR的检测灵敏度远远大于普通PCR。盛蕾等30设计了以CAMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE4的外源基因为检测对象的特异性半巢式PCR引物，在反应中选取油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内源参照基因，反应灵敏度可以达到0.001%。1.3.2.5 其他PCR方法此外，还有热不对称交结PCR、免疫层析法等一系列检测方法31。Yang等32设计了针对油菜Oxy-235插入片段的特异性引物和探针，采用热不对称交结PCR法进行了扩增，可以定性和定量检测Oxy235菜籽。张隽等33依据玉米品系MON89034中外源基因的插入位置设计不同的引物，并在其中选取出最佳反应引物，优化了反应体系和反应条件，成功的建立了一种特异性检测MON89034转化体的LAMP方法，该方法可以特异性检测出MON89034玉米,其检测限为1 pg。鲍蕾等34建立了一种免疫层析法，这种方法可以迅速的检测出植物油中的玉米赤霉烯酮的含量，该反应的灵敏度为10g/kg。Shiro Fukuta等35根据大豆中的外源基因CaMV35S启动子设计了6种引物并进行环介导等温扩增，其检测限为0.5。1.4生物芯片技术近年来即使分子生物检测学技术的发展迅速，但是由于基因序列插入的不确定性，检测不同的的DNA序列难度逐渐加大，应用传统实验方法费时费力，已无法完全的地获得和了解越来越多的碱基对信息，人们需要一种新的技术手段来研究众多基因的多态性变化，从而认识它们的功能，了解它们的相互作用和调控关系。在这样的情况下, 上个世纪80年代，随着人类对分子生物学方面的不断探索，微流体芯片( gene chip)技术就产生了，在分子生物学研究中，它整合了样品处理、检测和分析过程，这不仅省去了大量的重复操作的费用和时间，也可以用很少的被检样品能得到其包含的很多生物信息，这是传统的其它检测方法(如核酸杂交、抗原抗体免疫反应等)不可比拟的。生物芯片根据碱基对之间相互结合的原理，应用了缩微技术，将分子生物学检测中不连续的分析过程变成连续，将反应物质结合在芯片载体的表面，以实现对生物体内的组分的测定能够快速、准确，更主要的是生物芯片的检测过程是平行的，因此，所得结果可能更加接近生物体内的实际情况。同时也增强了各种信息间的可比性。按照芯片上检测成分的不同，生物芯片被划分成基因芯片、细胞芯片、组织芯片和蛋白质芯片36。1.4.1基因芯片技术 21世纪以来,生物学相关学科发展迅速，越来越多的生物基因组需要测定，基因芯片在这种情况下就应运而生。基因芯片技术应用十分广泛，在确认基因功能、诊断疾病分子水平、检测病原体、发现疾病易感基因等医学与生物学和筛选多靶位同步超高通量药物领域得到广泛应用37。基因芯片利用微细加工技术 ，将大量的特定序列的基因探针，按照某种规律固定于面积十分小的载体玻片上，这样就构成了一个二维DNA探针阵列，该阵列可以和待检物质按照碱基互补原则结合。1.4.1.1 基因芯片技术原理基因芯片技术是根据碱基互补的原理人为设计一小段基因片段（也就是特异性的探针），在该片段上连接一些可检测的物质，这种物质能与待检样品中的某种特定序列结合。通过平面微细加工技术以及超分子自组装技术把大量的基因探针集成在一个2c的硅片上，从而实现对待检植物组DNA的大规模检测。基因芯片的测序原理图1.4.1.2基因芯片技术分类按照芯片的功能不同可以将芯片分成两种：测序芯片和表达芯片38。基因表达芯片可以将数以万计的基因检测探针固定在一块DNA基质膜上，对来源于不同的个体、不同发展周期的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，它能够进行综合不同阶段的分析和判断，加快这些病理基因的确定39。 另外基因芯片根据探针的类型不同也可分为两类：cDNA微阵列和寡核苷酸芯片；根据应用范围的不同而分为专用芯片、P53基因检测芯片、病毒检测芯片等40。1.4.1.3基因芯片技术的发展现状目前，基因芯片技术发展迅速。在20世纪末期，转基因番茄作为世界上第一个转基因植物产品在进人市场后，转基因农作物以一种迅速的发展模式席卷全球。20世纪末期美国投入了将近20亿美元科研经费用于研究基因芯片这项技术。紧接着，世界各国看到了基因芯片技术的巨大发展前景，也纷纷开始研究基因芯片，将基因芯片列为主要发展的产业正在全球崛起，目前生物芯片的产值十分可观，近几年达到了10亿美元左右，据估计生物芯片的工业产值在五年后将达到200亿美元 41。基因芯片技术把百万甚至千万个与生命相关的基因片段通过微加工工艺固定在面积极小的芯片上，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，它的出现将给众多的科学领域带来巨大的变革。1.4.1.4基因芯片技术的应用1.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用基因芯片技术在检测微生物方面应用十分强大42，它能够一次性的检测出全部存在的病原微生物，并且能够检测特定致病菌株的所有遗传学指标。与传统的检测手段，比如说生化实验、血清实验等相比，基因芯片在微生物领域具有以下优势:高通量且并行检测操作时间短，方法简洁，整个过程大概需要4h，大大缩减了检测时间与传统方法相比，灵敏度提高43。Volokh等44应用基因芯片鉴定了6种李斯特菌;Call等45通过研究E.coli 0157:H7的志贺样毒素I . II及溶rfn.素A，证实了基因芯片技术在检测这种大肠杆菌分离物方面十分准确; 陈昱等46提供了一种基因芯片和多重PCR技术相结合的检测方法，该方法在检验沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌O157方面十分准确、快速，且灵敏度比较高。 Keraamas等47利用基因芯片检测并鉴定了2种十分相近的大肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌（两种菌均来自鸡粪便中），对今后禽流感病毒的防备和治愈方面大为有益。1.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用 因为短期内关于转基因食品是否安全并没有一个明确的结论，并且消费者有权知道所购食品是否具有转基因成分，各个国家大体上都采取了转基因食品的“说明标签”制。但是，某些不法商家为了谋取利益，经常违背这项规定。对于这样的情况，政府和企业的各检测部门都十分需要一种能够精确检测食品中转基因成分的手段。但从目前的PCR扩增法，无论是单重还是多重PCR检测只能对其中几种转基因成分进行检测，耗费时间长、效率低，当食品中有大量转基因成分时，不能进行快速检测。而基因芯片将大量的探针固定于其表面，单做1个实验就可以筛选出大量的不同转基因成分，因而基因芯片技术被认为是在检测转基因成分中最具潜力的手段之一。Rudi等48制作了一种及基因芯片用来检验玉米中转基因的含量，结果表明在7份待检产品中，主要包含了Bt176. Bt11. Mon 810. T25. GA21. CBH351和DBT418等七种转基因品系，其中1份样品检出含有玉米品系基因GA21。与常规的转基因检测方法相比，其检测限为0.10%-2.0%，因而此系统被认为可适用于将来基因修饰生物genetically modified organisms检测的需要。成小薇等53通过PCR对样品核酸进行扩增，将扩增产物与固定于可视芯片的特异性探针进行杂交分析，优化了芯片杂交的温度和时间，结果证明了芯片的特异性和重复性都较好，该芯片可以同时检测大豆、水稻、小麦、玉米、油菜等不同植物的转基因成分，且反应的灵敏度可达0.1。张广远等49根据定性PCR的扩增靶序列设计40bp大小的基因芯片探针，建立了上述MIR162、MON88017、MON89788、18S rRNA和MON88017、MS1、RF1、18S rRNA等7种转基因品系基因芯片检测方法，结果证实了该方法的反应灵敏度较高(0.01%)。1.4.1.5 基因芯片存在问题与展望基因芯片技术的应用前景十分光明，但在实际检测中，仍有各种问题函待解决，包括:基因芯片技术在设计探针时，需要知道很多的己知道碱基序列的DNA或cDNA片段的序列，而目前来看，由于基因片段插入的不确定性，很难检测出未知的核苷酸片段;芯片制作的工艺比较复杂，需要高精度的制备和专门的仪器设备来检测信号源，制取费用很高，一般实验室不能承受该费用;由于芯片的质量控制标准也没有统一的标准，造成芯片的制备也十分复杂。技术本身也存在一些问题，大致可概括为(1基因探针与靶DNA之间的的杂交出现问题：未配或错配;(2)靶DNA会形成复杂的空间结构;(3)计算机对靶DNA的重复序列识别模糊;（5)由于芯片技术的高科技型，在共享数据和资料库等方面还不够完善，基因芯片的种类和数目还比较少。在食品检测中以上这些原因都在不同程度上影响了基因芯片技术的发展。1.5 本实验研究的主要目的和意义本论文对不同加工程度的玉米基因组DNA的提取纯度进行了分析，然后针对四种不同加工程度的转基因玉米（未加工产品、粗加工产品、精加工产品以及深加工产品），建立了PCR和基因芯片两种检测方法，为一合理选择快速、简便、高效的基因组DNA提取、浓度测定以及转基因品系检测方法提供参考。主要研究内容包括以下几个方面: (1)以四种转基因玉米种子为材料，比较2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒，通过紫外分光光度检测，对提取得到的基因组DNA的纯度及两种试剂盒的提取时间进行分析。 (2)比较ABI公司的两台实时荧光PCR仪（ABI 7500和ABI viia 7）进行分析，结合两种不同试剂盒提取的DNA进行实时荧光PCR反应，分析四种不同加工程度玉米品系的检测情况。 (3) 利用基因芯片技术对四种不同加工程度的玉米产品进行扩增，分析比较和实时荧光PCR反应对玉米品系的检出率。(4)根据实时荧光PCR及基因芯片技术原理以及检出情况，提出一套完整、检出率更高的、更有效地检测玉米中转基因品系的方法，并对玉米中个别品系进行特异性分析。 (5)特异性产品：干酵母中转基因成分的检测以及按照优化的DNA提取试剂盒进行DNA提取，以及用实时荧光PCR技术和基因芯片技术进行品系鉴定。(6) 薯格中转基因成分和品系检测。11第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系为了确保植物组DNA的后续检测中实时荧光PCR和基因芯片反应能够进行，我们需要大致的了解DNA的纯度。本研究以玉米标准品为基准，玉米种子为材料，采用2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒提取四种转基因玉米产品（深加工玉米产品：玉米酒槽粕，轻度深加工产品：粉碎玉米粉，粗加工产品：粉碎玉米粒；未加工玉米：玉米颗粒）基因组DNA，对比不同方法提取的基因组DNA纯度及提取时间;各基因组DNA经ABI公司的荧光PCR7500和VIIA扩增，通过各样品的扩增曲线以及Ct值分析各样品的品系筛选情况；2.1 实验材料样品为送入辽宁省出入境检验检疫局的四种转基因玉米：玉米酒槽粕4504、粉碎玉米粉6979、粉碎玉米粒7167、玉米粒6743；待检薯格1864。2.2 实验仪器与试剂2.2.1 实验仪器表2.1 主要使用仪器名称 型号 生产厂家台式高速离心机 2-16P 德国Sigma漩涡振荡器 legend micro 172 德国IKA紫外分光光度计721上海亚津电子衡器有限公司实时荧光PCR仪 7500 美国ABI公司荧光定量PCR仪 VIIA 7 美国ABI公司八连管搅拌套TZL-1004苏州珀西瓦尔设备有限公司恒温水浴箱DHZ-3上海精宏实验设备有限公司Tab 2.1 The main use of the instrument2.2.2 实验试剂与耗材表2.2实验室试剂与耗材Table 2.2 laboratory reagents and consumables名称 型号 生产厂家Ex TaqDNA聚合酶 200次TAKARA公司ROX Reference Dye 200次TAKARA公司离心管 1ml QIAGEN 公司离心管 2ml QIAGEN 公司八连管 0.2 ml ABI公司微量移液器 10l、100l、1000l德国普兰德名称 型号 生产厂家Ex TaqDNA聚合酶 200次TAKARA公司 外源基因：启动子CaMV35S、Ubi，终止子NOS，筛选基因NPT（新霉素磷酸转移酶），PAT(修饰的草丁磷乙酰转移酶)，ZEIN（玉米内源基因