《亚麻木酚素的测定》编制说明VIP

1亚麻木酚素测定编 制 说 明西安中粮工程研究设计院有限公司2017 年 7 月2亚麻木酚素测定行业标准编制说明1 工作简况1.1 任务来源亚麻木酚素测定行业标准是根据国家粮食局标准质量中心2016 年度粮油行业标准制修订计划的要求，由西安中粮工程研究设计院有限公司负责进行制定。1.2 任务完成单位本标准的制定任务由西安中粮工程研究设计院有限公司主持完成。1.3 本标准主要工作过程该标准制定任务下达后，即成立了标准起草工作组，明确了项目负责人，制定了详细的工作计划，开展本标准修订的各项工作。按本标准制定进度，进行了本标准的调研和资料收集以及制定本标准的方案实施制订工作。查阅了与亚麻木酚素相关的资料和书籍，同时积极进行标准制定所需数据资料的调查、收集、整理、试验验证和统计分析工作。在该阶段工作中，详细分析和研究了有关亚麻木酚素生产、加工、应用及检测等方面的文献资料，结合我院前期亚麻木酚素提取工艺研究中对亚麻木酚素检测方法研发的基础资料，我们制订了本标准的实施方案。在标准制定过程中，从检测波长的选择、流动相选择、流速、柱温等方面进行优化，建立亚麻木酚素检测方法，并通过高效液相检测法对亚麻木酚素进行定性及定量分析。再经过试验验证和数据统计处理，形成本标准的草案稿。再经专家及相关起草单位共同探讨，形成标准征求意见稿。2 标准的编制原则和标准的主要内容2.1 标准编制原则在本标准的编制过程中掌握的总体原则是：确保标准具有科学性、适用性、先进性和可操作性，指导企业生产和商品贸易，还可以实现提取的标准化，规模化，集约化的工业化生产。实现产品的准确检测。编写规则是按照 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写 、GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准以及GB/T 1.2-2009 标准化工作导则 第 2 部分：标准中规范性技术要素内容的确3定方法的要求进行编写的。2.2 确定行业标准主要内容本标准包括适用范围、规范性引用文件、定义、原理、试剂、仪器设备、实验步骤、结果计算和检测报告等部分。3.主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果3.1 检测方法的建立3.1.1 材料亚麻木酚素样品：购自市售产品；标准品：上海源叶生物科技有限公司生产，纯度98%。乙腈，色谱纯；甲醇，色谱纯；去离子水。3.1.2 仪器高效液相色谱仪；BS124S 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；高速离心机 。3.1.3 检测波长的选择在 200nm400nm 范围内进行紫外光谱扫描，以确定检测波长。测定结果见图1，图 2。图 1 SDG 标准品紫外光谱扫描图4图 2 亚麻木酚素产品紫外光谱扫描图由图 1 和图 2 可见，SDG 标准品和亚麻木酚素产品均在 280nm 附近有吸收峰，因此，高效液色谱法选择波长为 280nm.3.1.4 流动相的选择在反相色谱分离体系中，流动相的组成一般为水、甲醇、乙腈或者极性有机溶剂的混合液等，本标准在控制其它条件不变的情况下，有机溶剂选取乙腈或甲醇作为流动相，考察不同流动相组成对亚麻木酚素的分离效果。本标准采用梯度洗脱，洗脱程序如下：T/min A(水) B（乙腈或甲醇）0 90 105 90 1015 73 2720 50 5025 90 1030 90 10图 3 甲醇水体系 SDG 标准品和亚麻木酚素样品图5图 4 乙腈水体系 SDG 标准品和亚麻木酚素样品图由图 3 及图 4 可见，SDG 标准品在两种体系中都分离较好，但是亚麻木酚素样品在乙腈-水体系: 样品中 SDG 对称因子为 0.94；理论塔板数是 224617；分离度 1.60；明显优于甲醇-水体系。因此选择乙腈水体系做为流动相。3.1.5 流速的选择流速是影响色谱柱效与分析效率的重要条件，因此有必要对流速进行优化，本实验在固定其他条件不变的情况下，分别选取流速为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min 进行检测，比较不同流速条件下的分离效果。分析结果见表 1表 1 不同流速条件下的分离效果亚麻木酚素样品 SDG 标准品流速 对称因子 理论塔板数 分离度 峰宽 对称因子 理论塔板数 峰宽0.94 246112 1.44 0.081 0.90 252263 0.0800.94 252997 1.39 0.080 0.92 252044 0.0800.80.93 252997 1.31 0.080 0.91 252028 0.0800.94 243835 1.34 0.0778 0.92 245618 0.07780.94 236860 1.31 0.0789 0.92 251784 0.07670.90.94 236985 1.30 0.0789 0.91 251983 0.07670.95 224569 1.63 0.0778 0.93 221671 0.07780.94 224658 1.59 0.0781 0.93 232060 0.07671.00.94 224617 1.60 0.0781 0.93 238905 0.07560.93 220310 1.52 0.0762 0.93 224136 0.075660.92 209881 1.51 0.0781 0.93 224249 0.07561.10.92 214975 1.49 0.0771 0.92 224249 0.07560.95 205546 1.70 0.0762 0.93 210537 0.07520.95 205662 1.70 0.0762 0.92 208946 0.07561.20.94 204950 1.73 0.0762 0.93 210777 0.0752由表 1 可见，流速为 1.2ml/min 时，样品中 SDG 对称因子平均为 0.95；理论塔板数平均是 205386；分离度平均为 1.71；峰宽平均为 0.0762。相比而言，优于 0.8、0.9、1.0 和 1.1ml/min,因此选择流速为 1.2ml/min。3. 1.6 柱温的选择在色谱分离中，柱温对于分离选择因子 和容量因子 k，为了获取最佳的 与 k 值，实验控制柱温在室温、30 、35 、40 四个水平，考察柱温对分离效果的影响。分析结果见表 2。表 2 不同温度条件下的分离效果亚麻木酚素样品 SDG 标准品温度 对称因子 理论塔板数 分离度 峰宽 对称因子 理论塔板数 峰宽0.94 205817 1.36 0.0767 0.92 212283 0.07560.94 206091 1.32 0.0767 0.92 212278 0.0756250.94 212324 1.31 0.0756 0.92 205918 0.07670.95 205546 1.70 0.0762 0.93 210537 0.07520.95 205662 1.70 0.0762 0.92 208946 0.0756300.94 204950 1.73 0.0762 0.93 210777 0.07520.92 202690 1.82 0.0762 0.92 208012 0.07520.93 203189 1.92 0.0762 0.92 218797 0.0733350.93 198557 1.78 0.0771 0.92 213306 0.07430.92 210215 1.92 0.0744 0.93 222768 0.07240.92 210189 1.89 0.0744 0.92 216608 0.0733400.92 203935 1.92 0.0756 0.92 228660 0.0714由表 2 可见，柱温为 35 时，样品中 SDG 平均对称因子为 0.93；平均理7论塔板数是 201479；平均分离度为 1.84。相比而言，优于 25 、30 和 40 ,因此选择柱温为 35 。最终确立液相色谱条件为：检测器为紫外检测器，检测波长为 280nm，流动相为乙腈水，流速为 1.2ml/min；柱温为：35 。梯度洗脱程序为：T/min A(水) B（乙腈）0 90 105 90 1015 73 2720 50 5025 90 1030 90 103.2 方法考查3.2.1 亚麻木酚素（SDG）标准曲线的建立将系列浓度的亚麻木酚素标准溶液，按建立的高效液相色谱法进行检测，记录相应峰面积。以峰面积为纵坐标，亚麻木酚素的进样浓度为横坐标绘制标准曲线并计算回归方程。3.2.1.1 标准溶液母液配置精密称取亚麻木酚素标准品19.88mg，置20mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容作为母液，（浓度0.99mg/ml）。3.2.1.2 标准使用液制备：准确移取母液lmL，2mL，3mL，4mL，5mL于 10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，备用。3.2.1.3 标准曲线相关性将上述系列浓度的亚麻木酚素（SDG）标准使用液，以峰面积为纵坐标，亚麻木酚素（SDG）标准使用液的进样浓度为横坐标绘制标准曲线（见图 5）并计算回归方程。8图 5 亚麻木酚素（SDG）标准曲线图则标准曲线:y=3393.39509x-2.97962 R 2=0.9998从图 5 及回归方程来看，亚麻木酚素在 00.4906mg/ml 范围内线性良好，相关性达到 0.9998.3.2.2 重复性实验 取低、中、高（0.1、0.3、0.5 mg/mL）三种不同浓度的亚麻木酚素加标样品，每种分别采取不同实验人员在同一天测定 5 次的测定方式进行液相检测。根据测得峰面积得出实际样品浓度，计算测定结果的相对标准偏差（RSD） ，来评价方法的重复性。测定结果见表 3表 3 重复性实验结果一号检验员测量（n=5） 二号检验员测量（n=5） 检验员间 RSD样品浓度（mg/mL）测量浓度（mg/mL） RSD/%测量浓度（mg/mL） RSD/% RSD/%0.09811 0.09654 0.12 0.09747 0.34 0.960.2943 0.2914 0.24 0.2892 0.25 0.760.4906 0.5034 0.22 0.4972 0.32 1.24通过表 3 可以看出，不同浓度的样品，同一检验员测定 5 次，RSD 最大为0.34%，两位检验员之间的测定结果最大为 1.24%，说明方法的重复性较好。3.2.3 精密度实验取低、中、高（0.1、0.3、0.5 mg/mL）三种不同浓度的亚麻木酚素标准溶液，每种分别采取在同一天测定 5 次及连续 5 天的测定方式进行液相检测。根据测得峰面积得出实际样品浓度，计算测定结果的相对标准偏差（RSD） ，来评价方法的精密度。测定结果见表 4。表 4 精密度实验结果样品浓度 第一天测量（n=5） 连续测量（n=5）9（mg/mL）测量平均浓度（mg/mL） RSD/%测量平均浓度（mg/mL） RSD/%0.09811 0.09762 0.74 0.09713 1.170.2943 0.2896 1.69 0.2896 1.240.4906 0.4916 0.22 0.4970 1.12从表 4 的测定结果来看，同一天每一浓度样品测定 5 次，最大 RDS 为 1.69%，每一浓度样品连续 5 天测量，最大 RDS 为 1.24%，说明方法精密度较高。3.2.4 加标回收率实验3.2.4.1 标准样品加标回收率精密称取亚麻木酚素标准品19.88mg，置20mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容作为母液。准确移取母液lmL，2mL，3mL，4mL，5mL于 10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度制成(0.09811 mg/mL)、(0.1962mg/mL)、(0.2943mg/mL)、(0.3924mg/mL )、(0.4906mg/mL )，并注入液相色谱仪做标准曲线。取低、中、高（0.09811、0.2943、0.4906 mg/mL）三种不同浓度的亚麻木酚素加标样品，测定结果见表5。表 5 标准样品加标回收率样品理论浓度（mg/mL）测量平均浓度（mg/mL） RSD/% 回收率/%0.09762 0.74 99.50.09713 1.17 99.00.09654 0.12 98.40.098110.09747 0.34 99.40.2896 1.69 98.40.2896 1.24 98.40.2914 0.24 99.00.29430.2892 0.25 98.30.4916 0.22 100.20.4970 1.12 101.30.5034 0.22 102.60.49060.4972 0.32 101.43.2.4.2 样品加标回收率取一份已知含量的亚麻木酚素样品，向样品中分别添加已知含量的亚麻木酚素纯品，混合均匀，按照优化后的液相方法进行检测，根据目标峰的峰面积10和标准曲线计算实际样品含量，计算出样品加标回收率。测定结果见表 6。表 6 加标回收率实验结果样品理论含量（%） 样品实测含量（%） 实测/理论（回收率/%）29.5 100.329.0 98.629.6 100.729.4 100.029.429.9 101.735.9 102.334.4 98.035.1 100.034.6 98.635.135.2 100.352.5 97.953.7 97.853.0 98.953.2 99.353.652.6 98.1从表 5，表 6 的加标回收率可以看出，无论标准品加标回收还是样品加标回收率，均在 97.8%102.6%之间，可以满足方法的要求。3.2.5 检出限分别取梯度稀释溶液注入色谱仪，记录色谱图。当对照品主峰信噪比约为3：1 时，检测溶液浓度即为检出限浓度；本方法的检出限为 0.0002256mg/ml。3.3 实验室间考查（正在进行）3.4 技术经济论证及预期经济效果亚麻木酚素主要为开环异落叶松树脂酚（SECO） ，还有少量的MAT（鸟台树脂酚）等酚类物质。SECO通常是以SDG（开环异落叶松树脂酚二葡萄糖甙）的形式存在1。亚麻木酚素主要存在于亚麻籽中，一般约占籽重量的0.9%1.5%，亚麻籽中SDG含量约1%-4%，比其他66种食品高出75-800倍2。是与人体雌激素十分相似的植物雌激素。提取后的亚麻木酚素为黄褐色粉末。对雌激素依赖性疾病乳腺癌、前列腺癌、经期综合征、骨质疏松有预防作用。同时以木酚素SDG为主要原料的化妆品在预防或治疗肌肤衰老方面前景广阔。近年来，以加拿大、澳大利亚、英国和美国为主的西方发达国家，对亚麻籽作为功能食品的研究和开发作了大量的工作