酶循环法检测及其进展.pdf

2 8 6 国外医学临床生物化学与检验学分册 生 旦笙 鲞笙 塑 堡 竺 鲤 生 呈 酶循环法检测及其进展 宁勇 邹光楣 关键词 酶 循环 法 NAD P 氨基 酸 氧化还 原 酶类 1 9 6 1年 L o wr y OH 等应用两 种工具酶 建立循 环酶测定 方法 即 6 一 磷 酸 葡萄糖 脱 氢酶 谷 氨酸 脱 氢 酶的催化特性及酶偶联反应 的原理 使反应体系中 NAD P 一 NAD P H 循 环 变化 对 循环 中生成 大 量 的 6 一 磷酸葡萄糖 酸 用指示 酶 6 一 磷 酸葡 萄糖 酸脱 氢酶催 化 检 测 终 产 物 NAD P H 从 而 提 高 检 出 能 力 C h i MMY等改 进 L o wr y OH 酶 循 环法 即酶 双循 环 法 其操作方法包 括 待测样 品酶循 环 工具 酶 灭 活 加 入 指示酶双循 环 及对终 产 物检 测 本文 对酶 循 环 动 力 学研究 临床生化检验及环境监测中的应用作一介 绍 o 6 P 6 P O NADI r G L U N I d d K G 图 1 酶 循环 荧光 法 分 光法 测定 原理 G 6 一 P 6 P G NADP 十 NA DP H I 鏖I 哇监 P MS 图 2 酶 循环染 料 比色 法测 定 原理 酶循 环法原理及方 法 1 酶循 环 法 是 采 用 两 种工 具 酶 进 行 的 循 环 反 应 使被测物放大扩增 从而提高检测灵敏度的酶学 分析方法 1 9 6 1年 L o wr y OH 等将 葡萄糖 6 一 磷 酸脱 氢酶 g l u c o s e 一 6 一 p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e G6 P D 催 化 6 一 磷 酸 葡 萄 糖 G6 P 脱 氢 生 成 6 一 磷 酸 葡 萄 糖 酸 6 P G 和 还 原 型 辅 酶 NADP H 谷 氨 酸 脱 氢酶 g l u t a mi c d e h y d r o g e n a s e GL DH 催化 谷氨酸 氧化脱 作者单位 4 3 0 0 6 4武汉 湖北药检高等专科学校医学检验系 继 教 园 地 氨 谷 氨酸 氧化 型辅 酶 1 I NADP 一NH a 一 酮戊 二酸 NAD P H 此 反应 的平 衡点 偏 向 于合 成 谷氨酸 的反应性 质及特 点 建立 可 以提 高检 出能力 的 酶循环法 酶循 环荧 光法 分 光法 测定 原理及 酶循环 染料 比色法测定原理见 图 1 图 2 2 酶双循 环法 在实 验 中发 现 酶循 环放 大 能 力 实际只有 2 3 倍 达不到理论所讲循环 1 h可扩大 1 5 0 0 0倍能力 这是 因为反应 体系 中 NADP含 量低 属 一 级酶促反应 反应体系 中需 加 大工具 酶酶 量 以保 证 检定能力 加 大工 具酶 G6 P D酶 量 增 加 与 NADP 结合 能 力 的 同时 也 会 增加 对 NAD PH 的 结 合 能力 因为 G6 P D对 NADP 及 NADP H 的 K 相 同 分 别 为 K 一1 O mo l L及 K 一1 O mo l L 在酶 循 环过 程 中 有 时 还 出 现 酶 对 NADP H 结 合 率 大 于 对 NADP 的现象 这是 随循环 时间延 长 反应速 度 明显 下降的原 因 即使在合适 的实验条件下 循环反应 1 h 反 应 速 度 会 下 降 5 2 以上 Ch i MMY 等 改 进 L o wr y OH 提 出 的酶 循 环 法 即酶 双 循 环 法 d o u b l e c y c l i n g 酶 双 循 环 法 试 图 克 服 酶循 环 中 动 力 学 弊 病 将酶循 环反应 分成 四个 步骤 两种 工具 酶酶 循环 酶循环后 工具酶灭活 加入指 示酶 双循 环及对终 产 物 检 测 1 酶 循 环 样 本 与 酶 循 环 试 剂 在 3 7 反应 1 h 反 应 放 大 为 每 摩 尔 NADP 可 生 成 1 7 0 0 0 too l 6 P G Hi n t z CL等 推 荐 酶 循 环 试 剂 组 成 咪 唑一 HC 1 缓冲液 p H7 0 G6 P a K G M 醋酸铵 小牛血清与 足够 的工具 酶 2 灭活 有碱 灭活 加热 灭 活及 去垢 剂灭活方 法 加碱法 加 Na OH 中和 H 并 形成 过量 oH一 随之 8 0 加热 2 0 mi n 加 热失 活法 Ts u n a wa k i S等 采 用 加 热 1 O 0 C 3 rai n Hi n t z CL 等 以 9 5 5 mi n即可 去垢剂 灭活法 由十二 烷基 硫酸 钠 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y S DS 或 S D H2 02组 成 灭活 试 剂 S D S H O 灭 活试 剂 效 果 满 意 操 作 简 便 易 于控 制 适 于手 工 及 自动 生 化 分 析 仪 上 进 行 3 酶双循环 加入指 示 酶 G6 P D 催 化酶 循环 生成 的 G6 P 后者再反应扩增 为 NAD PH Ch i MMY等推荐 二次 循 环 试 剂 咪 唑一 缓 冲 液 p H7 0 醋 酸 铵 Mg C1 2 E DTA NAD P G6 P D组成 4 产物 检测 维普资讯 国外医学临床生物化学与检验堂 生 旦箜 鲞箜 塑 坠 望 坠 型 兰 对生成的 NADPH 可 采用 荧 光 紫 外分 光光 度 比色 法测定 动力学研究 微 量底物在快 速 酶循 环 反 应 中酶 活性 的选 择 是 一 项非常重要的动力学参数 这种动力学参数为表现 一 级反应 速率常数 K 由于 K V K 故 K K 即转 换 率 V 即表 示 两 种 工 具 酶 分 别 为 NAD P NADP H 饱和 时 的最 大 反应 速 度 当 反应 达 到 稳 态 时 NADP 和 NADP酶循 环 中发生氧化 还 原反 应的 反应速度相等 即 K NA D P 一K E N AD P H K K 表示 E E 的表现一级 反 应速度 常数 将 两 种工 具酶的总量控制在 1 0 g ml 两 种工具 酶 按不 同用 量 比可 以通过理论计算或实验发现 最佳工具酶用量 G6 P D2 2 g ml GL DH7 8 g ml 温 度 在一 定 范 围 内升高 延长循环时 间会 增加 反应循 环次数 阴离子 明显抑制酶循 环反应 抑制 机理 为使 G6 P D的 K 升 高 不 同阴离 子 可 以使 K 出现 1 8 2 0 0 m 变化 在 p H 7 4时 循环率明显下降 下降原因为酸性条 件使 NAD PH 变 性 酶 循 环 中 激 动 剂 有 E DTA ADP Mg C l 2 及 Tr i t o n X 1 0 0 酶循环 法应用 1 酶循 环法应 用 郑海 霞 等建立 酶循 环法测定 血 清 NAD P 和NAD PH 血 样 用 碱 性 处 理 除 出 NAD P 而保 留 NAD PH 用 酸 性 处 理 除 出 NADP H 而保留 NA D P 将 酸碱 处理 的血样与 N A D P 和 NAD PH标 准液分别进 入酶循 环反 应 反应终 止 时检 测 5 7 0 n m 反应生成 的蓝 色 甲欣 F o r mo s a n s 实验结 果表明 酶循环法具有准确 重复性高 操作简便等特 点 其灵敏度显 著提 高 检 出限为 1 0 mo l 酶循环法 测定 血 中总 胆 汁 酸 利 用 3 a 一 羟类 固醇 脱氢酶 3 a H S D 的可逆性催化胆汁酸与 3 一 氧代胆汁 酸互 变的特 点 建立 的酶 循 环法 顺 反 应 催 化胆 汁 酸 脱下 的氢 由硫 代 氧化 型 辅 酶 t h i o NAD 接 受 生 成还原型辅酶 t h i o NA D H 而逆反应催化 3 一 氧代 胆汁酸从 NADH 得到氢生成 NAD 和胆汁酸 酶循 环中生成大量 的 t h i o NADH 在 吸收峰 3 9 0 4 1 0 n m 处的检测 换算出微量胆汁酸含量 一 氧化氮合 酶 NOS 催化精 氨 酸 NAD PH 氧 反 应生成胍 氨酸 NA DP 一氧化 氮 NO S活性 测定 的 方法主要有测定胍氨酸 一 氧化氮 由于方法学 的弊病 限制了其应用范围 Wa n g W 等对组织细胞的 N O S催 化生成 NAD P 测 定 将 N ADP 经 酶循 环法 循环放 大 成为 NAD P H 在 3 4 0 n m下检测 以吸光度 的变化换 算 为 NOS活性 其放大倍数 为 1 0 0 0 4 0 0 0 2 酶 双循 环法 的应用 Ts u n a wa k i S等应 用 酶双 2 8 7 循环 法 测 定 血 中 巨噬 细 胞 N AD P NA D P H 及 N A D P H NA D P 比值 作为巨噬细胞捕 杀血 中入侵 的微生物 对抗肿瘤细 胞能力 的指 标 取 含 巨噬细 胞 1 0 j 个 ml 大鼠外周血 在细胞溶解剂作用下使 巨噬 细胞溶解 细胞溶解样品分别经 6 0 放置 1 0 mi n 维 生素 C酸性 处 理 样 本 分别 保 留 NADP NADP H 对 含 NAD P NADPH 样品分别进行 酶双循 环 可测 定 巨噬 细 胞 NAD P NADP H 及 NADP H NADP 比值 NADP 与 NADP H 的放 大倍数 为 1 6 7 1 0 Te u t s c h HF等用 酶 双循 环技 术测定 大 鼠不 同 区 带肝细胞中 G 6 P D的活性 先制备不 同区带肝细胞 样 品 分 别 与 G6 P D 试 剂 AMP缓 冲液 小 牛血 清 NADP G6 P 2 5 反 应 1 h 生成 微 量 NADP H 对 生成微量 的 NADP H 行 酶双循环放 大测定 与 同时进 行的空白 标准比较 计算扩增 N AD P H含量 再换算 出各区带肝细胞中 G 6 P D的活性 L e w i s B L等利用双循环法原理 对样本 中含有 p mo l f mo l NA D P H 在 离心 式 全 自动 生化 分 析 仪 C F A 中测 定 C FA可 自动 进行 开 始 分 析 终止 及 数据处 理 测定 时 取 5 t d样 本 2 p 1 稀 释 液 2 O l 循环酶试剂反应 1 h 然后加入灭活试剂 1 h后加入指 示 酶试 剂 0 5 s 后 开始记 录 3 4 0 n m 吸光度 改变 每隔 7 s 记 录 1次 共 3 O次 由 f AA F F一1 s Vs 计算 NADP H 量 S为 比色皿 底 部 面积 Vs为 比色 容积 6 2 2 1 0 mM c m一 则 F一8 0 3 8 5 8 Yo u n g D等利用 酶双 循环 在分 离式 自动生 化分 析仪 C F A 一 型 中测定牛晶状体 N AD激酶 NA D 激酶可 以催化 NA D 生成 NA D P 该酶在组织中 分布 广 大 鼠脑 猴 豚 鼠视 网膜及红 细胞 中 具有重 要生理功能 该酶催化反应能将戊糖旁路代谢途径 与体内氧化还原反应联系起来 检测方法为两个阶 段 第 一 阶 段 由 NA D 激 酶 催 化 NA D 转 变 为 NADP 第 二 阶段采用 酶双循环 法检测 NADP 量 Yo u n g DA 等采用 酶 双 循 环法 对 肌 细 胞 中 I MP 进行检测 I MP是体 内 AMP和 GMP 的前体 物 对 肌纤维运动具有调节作用 I MP检测原理 第一阶段 使 I MP反应生成 R 一 1 一 P I MP P i 核苷磷酸化酶 二 竺 重 竺 堕 I R P i I R L C 十 一 R 一 1 一 P 第 二 阶段 对 生成 的 R 一 卜P行 酶双循环放大 酶双循 环原理 见 图 3 R 1 P p P G M 磷酸化磷酸葡萄糖转位j G岳P R I 一5 P P G M 脱 磷 酸 磺 酸 葡 萄 糖 转 化 酶 人G 1 6 1 G6 P NAD P 四q 6 P d NA DP H 2 图 3 酶双循 环 法原 理 3 酶循环法在环境监测中的应用 环 下转封三 维普资讯 国外医学临床生物化学与检验学分册 2 0 0 4年 5 月第 2 5 卷第 3期 S e c t C l i n B i o c h e m L a b Me d F o r e i g n Me d S c i Ma y 2 0 0 4 V o l 2 5 N o 3 输血疗 法 基本技能是指相关的实验操作方法和能力 输 血 医学 中血 型 的检验 血液 安 全性 指 标 的测 定 成 分 的制备等均要求严格按照操作规程和各项规章制度 进行 掌握这些基本技能 才能使输血发挥最大疗效 如新鲜冰冻血浆的输注 应首先将其在 3 7 水浴条件 下不断摇动中融化 并在短时间内进行输注 2 4 h内 如果不按照要求在 3 7 水浴条件下融化 而是在室温 下自然融化 就会有大量纤维蛋 白析 出 融化后的血 浆如不尽快 输注 血浆 蛋 白将 会 变性 不 稳定 的凝 血 因子也会丧失 活性 输血 医学教 学应 注重理论和实践相结合 输血 医学 是一门实践 性很 强 的学 科 在 教学 中应 注重理论和实践的结合 如血小板在临床上的应用 过去因血小板减少引起的出血患者都是输注全血 但 全血 中血 小板 含量低 疗 效 差 从 全血 中分 离制 备 的 浓缩血小板因含量高 对治疗 因血小板减少引起的出 血患者具有 良好疗效 明显优于输注全血 因此 人们 逐渐放弃输全血来治疗血小板减少导致 的出血 后来 发 现手工法制 备 的血 小板 中可 混入 较 多 的 白细 胞 和 红细胞 而且临床应用时需多个供血者的血小板才够 一 个治疗量 可产生 同种免疫导致血小板输血无效 如采用人类白细胞抗原相合 的血小板则可改善疗效 现在可采用血细胞分离机单采供者的血小板 由于其 混入的白细胞和红细胞均得到了 良好的控制 血小板 质量明显提高 且单个供者的血小板就能满足临床需 要 疗效好 由此可以看 出 血小板制剂每一次输注 方式的变革都来源于医疗实践 临床应用过程 中的 需要对输 血医学 提 出 的新 问题 不 断促 进 了输 血 医学 的进步和发展 丰富了输血医学研究的内容 总之 输血医学是一门实践和临床 紧密结合 实 践和理论并重的学科 教学中既应注重学生基础理论 和基本知识的掌握 还应注重对学生基本技能的培养 和训练 收稿日期 2 0 0 4 0 4 1 8 本 文编辑 杨 庆华 上接第 2 8 7页 境污染对生物体造成极大 的影响 污染物影响生物体 活性大 分子 并且 以食物链 方式 危及 人类 健康 通过 环境污染物对生物体活性物质检测