与浓缩苹果汁后混浊有关的蛋白质组成分析

与浓缩苹果汁后混浊有关的蛋白质组成分析李 娜，李全宏 * ，蔡同一(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)摘 要：从新鲜苹果和浓缩苹果汁中分离纯化蛋白质，用肽质量指纹谱对其进行鉴定，测定氨基酸组成和多酚及多糖的含量，结果表明，新鲜苹果蛋白的主要组分为Thaumatin-like protein 1，是一糖蛋白，其疏水性氨基酸含 量高，易引起苹果汁的后混浊。浓缩苹果汁中蛋白组分比较复杂，在贮存过程中与多酚及多糖发生结合，使分子 量增大，其分子量均大于新鲜苹果蛋白。关键词：浓缩苹果汁；蛋白质；肽质量指纹谱；氨基酸分析StudyonAminoAcidAnalysisandCharacterationof ProteinInvolvedinPost-hazeofAppleJuiceConcentrateLI Na，LI Quan-hong*，CAI Tong-yi(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing100083, China)Abstract：Thepurposeofthisstudywastoisolateandpurifyproteinsfromfreshappleandapplejuiceconcentrate,identifytheseproteinsbypeptidemassfingerprinting,determinethetotalpolyphenolandpolysaccharidecontent,andaminoacid analysis.TheresultsshowsthatThaumatin-likeprotein1isoneofthemajorproteinconstituentsoffreshapplefruit,itisa glycoproteinandrichinhydrophobicaminoacid,itisreadilycausepost-hazeinapplejuice.Proteinsinapplejuiceconcentrate were more complex, it is combined with polyphenol and polysaccharide and made molecular accelerate, and cause post-haze finally.Key words：apple juice concentrate；protein；peptide mass fingerprinting；amino acid analysis中图分类号：TS255.1文献标识码：A文章编号：1002-6630(2005)08-0106-05苹果及苹果汁中的蛋白质含量很少，但是蛋白质与浓缩苹果汁的后混浊有着重要的关系。蛋白质形成混浊 的机理除了蛋白质热变性聚合以外，主要是由于蛋白质 与酚类物质形成了蛋白质酚类化合物的大分子聚合物，这也是迄今为止最难控制的混浊1，蛋白质与花青素相互作用，特别是氧化、聚合，导致了蛋白质 酚类聚合物的形成。现代工艺使用液化酶，溶解了部分细胞壁的糖蛋白收稿日期：2005-05-28*通讯作者作者简介：李娜(1972-)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程。13:175-187.唐传核.米糠油来源生育三烯酚生理功能作用J.粮食与 油脂,2002,(2):35-36.JariwallaRJ.Rice-Branproducts:phytonutrientswithpo- tentialapplicationsinpreventiveandclinicalmedicineJ. DrugsunderExperimentalandClinicalResearch,2001,27(1):17-26.Taylor J B, Richar T M, Wilhelm C L, et al. Rice bran oilantioxidantP.US5552167,1996,11.严梅荣,顾华孝,马云,等.微波加热稳定米糠研究J.中 国粮油学报,2002,17(4):28-31.Iwata T, Kamegai T, Sato Y, et al. Method for Producing Conjugated Linoleic Acid P. US 5986116, 1999, 11. SaeboA,SkarieC,JeromeD,etal.Conjugatedlinoleicacid compositions and methods of making same P. US 6410761,2002,6.131614171815基础研究食品科学2005, Vol. 26, No. 8107进入果汁中，近十年对细胞壁的结构糖蛋白进行了深入研究，Jose 及 Liyama 都指出：细胞壁的结构糖蛋白主 要是凝聚素、阿拉伯糖蛋白及其衍生物，其含有大量 的羟脯氨酸、阿拉伯糖和果糖2,3 。实验证明：细胞壁 蛋白含有的羟脯氨酸和混浊有关。Hagerman 蛋白质 - 单 宁模拟体系研究表明：蛋白质脯氨酸含量高4，蛋白质 易于和单宁相互作用，形成沉淀。并且，果汁中的蛋 白质还可以发生自身聚合，引起混浊5 。因为苹果中的蛋白质含量很少，以往的研究都是选 用含脯氨酸较多的蛋白质如明胶和麦醇溶蛋白来建立模 拟体系6,7，从苹果和苹果汁中直接提取蛋白进行研究鲜 有报道，本文采用盐析法和离子交换分别从新鲜苹果和 浓缩苹果汁中提取纯化蛋白质，对其进行氨基酸分析， 应用肽质量指纹谱对蛋白进行鉴定，以期对苹果汁加工 中易引起苹果汁的后混浊的蛋白质组成分析与性质进行 深入研究。 进样量：5 0l 。离子交换层析 将冷冻干燥后的新鲜苹果粗蛋白和浓缩果汁粗蛋白1.2.3上 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱层析(26 16)，分别以0.2、0.4、0.6mol/L 的 NaCl(磷酸钠缓冲溶液，pH6.2)进 行阶段洗脱，流速 1ml/min。将收集到的蛋白充分透析 后冷冻干燥。1.2.4蛋白中总酚含量的测定(普鲁士蓝法)离子交换得到的蛋白透析、冷冻干燥、称重。然后将其溶解于一定体积的水中，取 1ml 样品于 25ml 容量瓶内，依次加入0.5ml 0.1mol/L FeCl3，0.5ml 0.8mol/L的 K3Fe(CN)6 和 0.5ml 0.1mol/L HCl，定容，于 695nm 测定 吸光度。用单宁酸为标准物作标准曲线。1.2.5蛋白中多糖含量的测定(苯酚-硫酸法)离子交换得到的蛋白透析、冷冻干燥、称重。然后将其溶解于一定体积的水中，取 0.5ml 样品于 10ml 试管中，依次加入 0.5ml 苯酚和 2.5ml 浓硫酸，静置 30min，490nm 测吸光度。用葡萄糖为标准物作标准曲线。1.2.6 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分离胶和浓缩胶的浓度分别为 15% 和 5% ，样品和 标准相对分子量蛋白的上样量均为 20l，电泳时间 3h 左右。0.1% 考马斯亮蓝 R-250 染色 2h ，脱色后拍照。1 材料与方法1.1 材料和仪器苹果浓缩汁山东烟台北方安德利果汁股份有限公司提供；高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发器上海申顺生物科技有限公司；真空冷冻干燥机 军事医学科学院实验仪器厂。1.2 方法1.2.7肽质量指纹谱(PMF)将电泳及染色后凝胶中的蛋白带切下，用干净的刀1.2.1苹果粗蛋白的制备小国光苹果破碎，压榨，将果汁离心(12000r/min，片将胶带切成 12mm2 大小的胶片，用水清洗几次后用含 50% 乙腈、25mmol/L 碳酸氢铵的溶液 50100l 浸泡 胶片，震荡 20min，弃去溶液，重复 1 至 2 遍至胶片中的 蓝色褪尽。将胶片真空离心干燥 20min，使其完全脱水体 积缩小，加入 510l 酶液(0.01g/l，含 25mmol/L NH4HCO3)，4 冰箱中放置 2030min，待酶液完全被 吸收，补充 510l 25mmol/L NH4HCO3 液，37保温15h。加 5%TFA 50100l 于 40保温 1h,吸出上清液， 加 2.5%TFA、50%ACN 50100l 于 30保温 1h，吸 出上清液，合并上清液，冰冻干燥。加 510l 0.5% TFA 溶液混匀用于 MALDI-TOF-MS 质谱分析。10min)，上清液加入 80% 的甲醇，离心(12000r/min，10min)，沉淀用冷丙酮洗两次，复溶于水中，加入 80% 的饱和硫酸铵， 搅拌， 静置过夜， 高速冷冻离心 (12000r/min，20min)，沉淀透析后真空冷冻干燥，得 到新鲜苹果粗蛋白。浓缩苹果汁加水稀释至 11.5Brix，高速冷冻离心 (12000r/min，20min)除去大颗粒不溶物质。上清液中加 入 80% 的饱和硫酸铵沉淀，静置过夜后离心(12000r/ min，20min)，所得沉淀透析。透析后真空冷冻干燥， 得到苹果浓缩汁粗蛋白。1.2.2氨基酸组成分析将上述得到的粗蛋白采用 HITACHI L-8800 型氨基酸2结果与讨论自动分析仪测定。样品用 6mol/L 盐酸于 110水解 24h，将水解液处理后蒸干(约 40)，加入 0.02mol/L盐酸，此 液上机测定氨基酸含量。色谱条件：离子交换柱：2.6 150mm ； 流速：0.225ml/min； 流动相：柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液；2.1新鲜苹果与浓缩苹果汁中蛋白氨基酸组成分析本实验中浓缩果汁为已经放置一年产生后浑浊的果汁，将此浓缩果汁稀释后可看见沉淀，高速冷冻离心可将此沉淀除去。由表 1 可知，无论是鲜苹果还是浓缩 苹果汁，天冬氨酸和谷氨酸的含量都很高，说明苹果 中酸性蛋白为主要蛋白组分。此浓缩果汁上清液蛋白检0.50.450.40.35 0.2mol/L NaCl280 0.3 0.4mol/L NaCl0.250.2 0.6mol/L NaClA50Fractionnumber食品科学基础研究1082005, Vol. 26, No. 0.080.060.040.020表1Table 1新鲜苹果和浓缩苹果汁中蛋白质的氨基酸组成A min o acid co mp osition o f fresh ap p le p ro tein an d a p p l e j u i ce c o n c en t r at e p r o t ei n 0.2mol/L NaCl蛋白质中氨基酸占总氨基酸的质量百分比(%)三字英文符氨基酸中文名称新鲜苹果浓缩苹果汁AspThrSer Glu Pro Gly Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Trp天冬氨酸苏氨酸 丝氨酸谷氨酸脯氨酸 甘氨酸 胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 色氨酸2.23.440.923.278.622.2Fractionnumber图 1新鲜苹果离子交换 DEA E-Sepharose Fast Flo w 柱层析洗脱曲线图Elu tion pro file of fresh ap ple p rotein from D E AE - S ep h aro se F ast F lo wF ig . 1图 2浓缩苹果汁离子交换 DE AE-S eph arose F ast Flo w 柱层析洗脱曲线图E lutio n p ro files o f ap p le ju ice co ncen trate p ro tein fro mD EA E -S ep harose F ast F lo w测不出脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸，而在鲜苹果中这三种氨基酸的含量都比较高，由此推断此三种氨基酸可能 与后混浊有关，而有研究表明，与苹果汁后混浊有关 的蛋白主要是脯氨酸、羟脯氨酸等疏水性氨基酸含量较 高的蛋白质8,9 ，本实验的结论与此是相符的。但是酪 氨酸可能参与混浊的形成还未见报道。2.2 新鲜苹果与浓缩苹果汁中蛋白的纯化将新鲜苹果和浓缩苹果汁经硫酸铵沉淀、透析、 冷冻干燥后的样品上DEAE-Sephrose Fast Flow离子交换 柱，用不同浓度的 NaCl(磷酸钠缓冲溶液，pH6.2)进行 阶段洗脱，如图1和图2所示，鲜苹果只有0.2mol/L NaCl 洗脱下来的一个蛋白组分，而浓缩果汁 0.2 、0.4 、0.6mol/L 的 NaCl 洗脱物都存在不同浓度的蛋白，主要蛋 白存在于 0.2mol/L和 0.4mol/L的NaCl 洗脱物中，而且每 个峰都存在拖尾现象，说明浓缩果汁中蛋白成分比较复 杂。将收集到的各组分分别透析后冷冻干燥进行下一步 试验。 2.3 新鲜苹果蛋白和浓缩果汁蛋白中多酚及多糖含量分 析表 2 是新鲜苹果蛋白和浓缩果汁蛋白中多酚及多糖 含量比较。用普鲁士蓝法10 测定离子交换后各蛋白组分中总酚的含量。无论啤酒、白酒还是果汁，造成混浊 的原因都和酚类物质有关。但苹果中的酚类物质大体有 四种，肉桂酸衍生物、黄烷类，黄烷醇及其糖苷、二 氢查尔酮及其糖苷和缩合单宁11。普鲁士蓝法测定的总 酚包括了所有具氧化还原性的酚类。实验结果发现鲜苹果蛋白中没有多酚，而浓缩果汁的蛋白混合物中存在F ig. 2表2不同原料中多酚及多糖含量比较Tab le 2Po ly p h eno l an d p o ly sacch arid e co n ten t an aly sis o f d iffe re n t ma te ria ls 原料多酚含量(%)多糖含量(%)新鲜苹果蛋白浓缩苹果汁蛋白7.63.057.577.6% 的多酚，说明经过储藏之后的浓缩果汁中的蛋白已经和多酚发生了结合。与很多蛋白与多酚的聚合物引起 后浑浊的报道吻合。用苯酚 - 硫酸法10测定离子交换后各 蛋白组分中多糖的含量，新鲜苹果蛋白和浓缩果汁蛋白多 糖含量分别为 3.05% 和 7.57%，由鲜苹果蛋白中多糖的存 在可以推测此蛋白是一种糖蛋白，而浓缩果汁中糖含量的 增加，说明在储藏过程中蛋白和多糖发生了结合。2.4 新鲜苹果蛋白和浓缩果汁蛋白 SDS-PAGE 分析 因为浓缩果汁蛋白已经和多酚及多糖发生结合，在电泳过程中，我们加入浓缩 5 倍的缓冲液，以增加蛋白 质浓度。由图 3 可见，鲜苹果有一条小于 31kDa 的蛋白 带，但是浓缩果汁在经过柱层析后有无数条带，其分 子量均大于新鲜苹果蛋白，结合上面对多酚和多糖的含 量测定可以推断出，苹果汁在储存过程中，随着时间 的延长或温度的变化，鲜果汁中蛋白会产生不同程度的 聚合或者和其它物质如多酚或多糖结合,由此产生了不同 分子量的新蛋白。加工过程中酶的添加也有可能是新蛋 白的来源。 A 280 13579111315171921232527293133353000 1226.631242.701300.581347.601639.901728.801816.87 2045.21 2185.102566.322650.3425002000150010005001300 1500 1700 1900 2100 2300 2500 m/z9000 950.46954.55 1158.561190.531650.68 1555.581808.701918.74 2729.12761.032832.0510000800070006000500040003000200010001200 1700 22002700 m/z基础研究食品科学2005, Vol. 26, No. 810998765431tein 1，由 247 个氨基酸组成，分子量为 25916Da，等电点为5.17。浓缩苹果汁选择66.2kDa左右的蛋白带进行 分析，查询结果表明这是一假想蛋白，以后的实验我 们将对其进行氨基酸测序，以更好的了解其性质。新鲜苹果蛋白质序列：MAMMKSQVAPRPTLAILFFFSGAHAAKITFTNNCP NTVWPGTLTGDQKPQLSLTGFELAS KASRSVDAPSPWSGRFWGRTRCSTDAAGKFTCETA DCGSGQVACNGAGAVPPATLVEITIAANGGQDYYDVSLVDGFNLPMSVAPQGGTGECKPSSC PANVNKVCPAPLQVKAADGSVIS CKSACLAFGDSKYCCTPPNNTPETCPPTEYSEIFEKQ CPQAYSYAYDDKNSTFTCSGGPD YVITFCP9740066200430003100020100144001、2、3 浓缩苹果汁 0.2mol/L NaCl 蛋白组分;4、5 浓缩苹果汁0.4mol/L NaCl蛋白组分; 6、7浓缩苹果汁0.6mol/L NaCl蛋白组分; 8、9 新鲜苹果蛋白 0.2mol/L NaCl 蛋白组分。Relative molecular mass (Mr103) of protein standards are given on the left sideofthegel.Theotherlanesareasfollows:1,2,3-eluateof0.2mol/LNaClof apple juice concentrate protein; 4,5-eluate of 0.4mol/L NaCl of apple juice concentrate protein; 6,7-eluate of 0.6mol/L NaCl of apple juice concentrate protein;8,9-eluateof0.2mol/LNaCloffreshappleprotein.表3 鲜苹果蛋白氨基酸组成Table 3 Amin o acid co mpo sitio n of fresh ap p le p ro tein图 3 柱层析各组分蛋白和鲜苹果汁蛋白的 SDS-PAGE 图谱F ig. 3 S D S-PA G E o f elu ates of fresh app le p ro tein and app le ju ice co n cen t rate p ro tein数目氨基酸含量(%)数目氨基酸含量(%)271151211412121623AlaLeuArg Lys Asn Met Asp Phe Cys Pro9.392282121318714GlnSerGlu Thr Gly Trp His Tyr Ile Val5.72.5肽质量指纹谱(PMF)鉴定新鲜苹果蛋白和浓缩果汁中蛋白质由表 3 看出，新鲜苹果蛋白中丙氨酸和脯氨酸含量较高，此类疏水性氨基酸极易和酚类物质结合从而引发 后浑浊。Dong Ha OH 等研究表明此蛋白是成熟苹果中 的主要组分之一，它是一种酸性蛋白，而且是一糖蛋 白12 。图 4新鲜苹果蛋白 PMF图F ig . 4 P MF pro files o f fresh app le p ro tein3结 论Thaumatin-like protein 1是新鲜苹果中的主要蛋白之一，是一种糖蛋白，其中疏水性氨基酸含量较高，易 和酚类物质结合引发苹果汁的后浑浊。浓缩苹果汁中的 蛋白组分比较复杂，在储存过程中和多酚及多糖发生了 结合，引起分子量增大，当分子量增大到一定程度时， 就会引起混浊或沉淀。图 5 浓缩苹果汁蛋白 PMF图P MF p ro files of ap ple juice co n centrate p ro teinF ig. 5参考文献：图 4 和图 5 分别为新鲜苹果蛋白和浓缩苹果汁蛋白的 PMF 图。使用国际互联网上的免费蛋白数据库 /search_form_pmf.html 检索程 序。检索结果如下：鲜苹果蛋白为已知蛋白，蛋白种 属为Malus x domestica，蛋白前体为Thaumatin-like pro-1Tajchakavit S, Boye J I Belanger D, et al. Kinetics of hazeformationandfactorsinfluencingthedevelopmentofhazein clarifiedapplejuiceJ.FoodResearchInternational,2001,34:431-440.Jose M, Purgdomenech P. Structure and expression of gases2食品科学基础研究1102005, Vol. 26, No. 8瞬时高压作用对膳食纤维可溶性的影响刘成梅，刘 伟，万 婕，阮榕生，梁汉萦(南昌大学食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德食品工程中心，江西 南昌330047)摘 要：采用以微射流均质机为物质基础的瞬时高压作用，对豆渣的膳食纤维进行物理机械处理，获取了瞬时高压作用处理前后膳食纤维可溶性受到的影响。物料经40MPa高压均质处理和经100MPa和120MPa微射流均质处理 后时，其可溶性膳食纤维的含量分别为 7.08%、17.51%，24.76%；总膳食纤维含量分别为 63.87%、72.19%、69.78%；可溶解性膳食纤维(SDF)含量与总膳食纤维(TDF)含量比值分别为0.1109、0.2424、0.3548；由此可见， 经瞬时高压处理后，样品的膳食纤维总含量和可溶性的含量均有所增加。 关键词：豆渣；膳食纤维；改性；瞬时高压作用InfluenceofInstantaneousHighPressureTreatmentontheSolubilityofDietaryFiberLIU Cheng-mei，LIU Wei，WAN Jie，RUAN Roger，LIANG Han-ying(The Key Laboratory of Food Science of MOE, Sino-German Food Engineering Center, Nanchang University,Nanchang330047, China)Abstract：UtilizingtheMicrofluidizermachineryasthecarrierofInstantaneousHighPressuretreatmenttodealwithdietaryfiberfrombeandregs,andthroughthephysic-mechanictreatmentofthedietaryfiber,theeffect ofInstantaneousHighPressure treatmentonthesolubilityofdietaryfiberbeforeandaftertheprocesshasbeenstudied.Undertheoperationpressureof40MPa100MPa and 120MPa, the soluble dietary fiber content of the material was 7.08% 17.51% and 24.76% respectively while thetotal dietary fiber content was 63.87% 72.19% and 69.78% with the SDF/TDF settled at 0.1109 0.2424 and 0.3548收稿日期：2005-07-05基金项目：江西省国家部委重点实验室专项基金(赣教字200509)；江西省自然科学基金(0430031) 作者简介：刘成梅(1963-)，教授，主要从事食品科学与工程的研究。codingforstructuralproteinsoftheplantcellwallJ.NewPhytol,1993,125:259-282.Liyma K, Lam T B T, Stone B A. Covalent cross-links in the cellwallJ.PlantPhysiol,19