淀粉酶活性测定.doc

淀粉酶活力测定及性质研究佟玥姗（东北农业大学，生命科学学院，生物科学，黑龙江省，哈尔滨市，150030） 摘要：本文以小麦为原料进行试验，分别采用凝胶扩散法，3,5二硝基水杨酸比色法测定小麦淀粉酶活性和总酶活性。首先，制作麦芽糖标准曲线，提取淀粉酶粗酶液，从温度、PH、激活剂及抑制剂对淀粉酶活性的影响。然后，通过剩余淀粉的含量判断淀粉酶水解效果，淀粉遇碘变蓝，颜色越深，淀粉含量高，淀粉酶活性越低。结果表明，40时酶活性最佳，PH=5.6是淀粉酶最适温度，氯离子是淀粉酶的激活剂，铜离子是淀粉酶的抑制剂。Taking wheat as raw material to test and gel diffusion method were used respectively, 3, 5-2 nitro salicylic acid colorimetric method to determine the wheat a - amylase activity and total enzyme activity. First, the production of maltose standard curve, extracting amylase thick enzyme fluid, from temperature, PH, the influence of activator and inhibitor on the amylase activity. Then, by the content of residual starch amylase hydrolysis effect, starch iodine blue in color, high starch content, the lower the amylase activity. The results showed that the activity of 40 best, PH = 5.6 is the optimum temperature for amylase, chloride ion is the activator of amylase, copper ion is amylase inhibitors. 关键词：淀粉酶活性；最适PH，最适温度；激活剂及抑制剂引言： 小麦是我国乃至全世界的主要粮食作物之一,其种植历史长、范围广,因而对于小麦品质的研究具有广泛的意义。在小麦的收获季节,遇到连绵阴雨天,就会出现大量的穗上发芽的现象,使小麦的品质严重下降,明显降低小麦的食用品质和工艺品质. 据报道,加拿大年产小麦约2500 万t.。芽麦率严重时可达15%,澳大利亚也有相似的芽麦率,欧洲几乎每年的芽麦率都相当高。 在我国也经常出现这种情况a -淀粉酶只有在小麦发芽时才能大量产生。正常情况下,小麦籽粒中缺少a-淀粉酶,a-淀粉酶的活性与发芽时的温度、发芽时间存在着密切的关系。 同时发芽小麦中由于a-淀粉酶活性很高,淀粉便会在a-淀粉酶的作用下分解成小分子,再进一步水解成糖类,所以低分子糖类含量也相应较高。本课题研究淀粉酶活性受温度，PH值，激活剂及抑制剂的影响。【1】1 实验材料与方法11材料 小麦（Triticum aestivum L.）、电子天平、研钵、容量瓶、量筒、刻度试管、试管、移液管、离心机、离心管、恒温水浴锅（40度、100度）、分光光度计、1淀粉溶液、0.4mol/L NaOH、pH=3.0、5.6、8.0的柠檬酸缓冲液1. 2方法1.2.1麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，分别编号1、2、3、4、5、6、7。依次分别加入麦芽糖标准液0mL、0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.0mL，蒸馏水2.0mL、1.8mL、1.4mL、1.0mL、0.6mL、0.2mL、0mL，3,5-二硝基水杨酸各2.0mL。（麦芽糖含量依次为0mg、0.2mg、0.6mg、1.0mg、1.4mg、1.8mg、2.0mg）药品加好后摇匀，置于水浴中煮沸5min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL，以1号管作空白调零点在520nm波长下比色测定光密度，以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.2淀粉酶粗酶液的提取称取0.5克萌发的小麦种子（芽长1cm左右）至研钵中加1g石英砂，研磨成匀浆，倒入25ml具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，混匀后在室温（20）下静置，每隔数分钟震荡一次，放置5分钟后，开始离心（4000r/min）10分钟，取上清液备用。1.2.3温度对酶活性影响 准备8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d，分别在A、B、C、D管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml，淀粉溶液2.5ml;在a、b、c、d管中加入淀粉酶提取液1ml，分别把A、a管放在4冷冻箱中,把B、b管放在室温下,把C、c管放在40水浴中,把D、d管放在沸水浴中,10min钟后把A管中的溶液倒入a管, 把B管中的溶液倒入b管, 把C管中的溶液倒入c管, 把D管中的溶液倒入d管,再把a管放在4冷冻箱中,把b管放在室温下,把c管放在40水浴中,把d管放在沸水浴中,进行酶促反应10min;最后在a、b、c、d管中加入碘液各3滴,并观察颜色变化情况。温度对酶活性的影响管号AaBbCcDd缓冲液（pH5.6）（mL）1.01.01.01.0淀粉溶液（mL）2.52.52.52.5淀粉酶提取液（mL）1.01.01.01.0预保温（10min）4 Aa4室温Bb室温40Cc40沸水浴Dd沸水浴混合酶促反应KI溶液各1-2滴（滴管先冷却至室温）显色蓝色蓝色无色深蓝色 1.2.4PH值对酶活性影响 准备三支试管分别编号、,在、管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=8.0的缓冲液柠檬酸2ml,淀粉溶液2.5ml,淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。pH对淀粉酶活性的影响操作管号缓冲液（pH5.6）（mL）2.0/（pH3.0）2.0/（pH5.6）2.0/（pH8.0）淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶促反应摇匀，40水浴10min碘液各三滴显色蓝色无色蓝色 1.2.5激活剂或抑制剂对酶活性影响 准备4支试管分别编号1、2、3、4, 第一步在1、2、3、4管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml;在1管中加入NaCl溶液1ml，在2管中加入CuSO4溶液1ml，在3中加入NaSO41ml，在4管中加入蒸馏水1ml，分别中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;分别在4只管中加入淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。 激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响管号123 44缓冲液（mL）各2.0mLNacl溶液（mL）1.0CuSO4溶液（mL）1.0NaSO4溶液（mL）1.0蒸馏水1.0淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶促反应摇匀，40水浴10min碘液各3滴显色透明淡蓝兰较浑较透明1.2.5小麦种子淀粉酶比活力的测定 取6支试管，编号，按下表操作酶活力的测定操作项目-淀粉酶活力测定总淀粉酶活力测定-1-2-3-4-5-6淀粉酶原液/mL1.01.01.0000钝化-淀粉酶置70水浴15min，冷却淀粉酶稀释液/mL0001.01.01.0预保温将各试管和淀粉酶置于40恒温水浴中保温10minpH5.6缓冲溶液/mL1.01.01.01.01.01.0NaOH溶液/mL4.0004.0001%淀粉溶液/mL2.02.02.02.02.02.0保温在40恒温水浴中准确保温5minNaOH溶液/mL04.04.004.04.0 将各试管摇匀，分别取2mL，放入25mL刻度试管中，再加入2mLDNS试剂摇匀，置沸水浴中煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL混匀，在分光光度计上520nm处进行比色，测定光密度，记录测定结果。2. 结果2.1麦芽糖标准曲线的制作原始数据试管00.20.611.41.82吸光值00.0330.1940.3460.5390.6580.7382.2温度对淀粉酶的活性的影响1）4：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；2）室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈蓝色；3）40：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色；4）沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色；由此可以看出40是小麦淀粉酶的最适温度。（从右向左）2.3 pH对淀粉酶的活性的影响1）PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色2）PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈淡蓝色3）PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈蓝黑色由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH（从左向右）2.4激活剂与抑制剂对淀粉酶的活性的影响1）空白对照组：加入碘液后呈蓝紫色2）加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色3）加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂（从右向左）2.5 淀粉酶活力的测定淀粉酶活性= A样品稀释倍数X定容体积 样品重*CA:2、3管淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量平均值 4、5管淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量平均值C：比色所用样品的毫升数总淀粉酶含量：218.75 mg/FW(g)5min3.实验讨论3.1结果总结与分析 1、由上述图片和数据可知，淀粉酶活性受温度的影响很明显，在一定的范围内，温度升高，淀粉酶活性增强，二者呈现线性关系。当温度达到40后，温度和淀粉酶活性的关系呈曲线，随着温度的上升，淀粉酶的活性增强不明显，甚至出现减弱的现象。淀粉酶的最适PH值为5.6，在PH值为3.0和8.0时，淀粉酶的活性均小于PH为5.6。淀粉酶活性的抑制剂是铜离子，激活剂是氯离子，两种离子的激活和抑制作用很明显 2、研究淀粉酶活性的影响因素是要用控制变量的方法，对单一变量进行研究，现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益【4】。 3、在研究-淀粉酶和总酶活性时，用高温时，-淀粉酶失活的性质，先处理酶粗液。-淀粉酶单一活性较强，总酶活性比-淀粉酶和-淀粉酶总活性强，说明两种淀粉酶有促进作用。 4、对于酶活力测定的方法有很多,比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法【3】,该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到-淀粉酶活性;再如2-氯-4-硝基苯-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定-淀粉酶法,该法用新底物2氯4硝基苯半乳糖麦芽糖苷（GalG2CNP）直接测定淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（15s），线性范围宽（可达2200UL），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂