林业生物技术 总复习资料.doc

第一章 绪论根据生物学研究与应用技术可以划分为细胞工程 基因工程 发酵工程 酶工程 蛋白质工程基因工程定义：将来源于不同生物的DNA在体外经过酶切、连接，构成重组的DNA分子，然后转入受体细胞，使外源基因在受体细胞中得到表达的过程。细胞工程定义：指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，创建新的种质、改良品种、改进繁殖方法及大规模生产生物产品的技术酶工程定义：酶学原理与化工技术相结合而形成的应用技术领域，它是在一定的反应装置里，利用酶的催化作用，将相应的原料转化为有关物质的技术。 发酵工程定义：将微生物、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物（工程菌）的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。 蛋白质工程定义：又称第二代基因工程，是利用基因工程等技术改良天然蛋白质的学科，它需要蛋白质化学、蛋白质结晶学、计算机辅助设计等学科的配合，通过对天然编码蛋白质的基因进行修饰，以获取比天然蛋白质更理想的新型蛋白质。 生物技术现状及展望美国：1999年政府投资高达180亿美元。 美国现有1300多家专业生物技术公司和15.3万多从业者，其生物技术产品销售额在1998年就达到了134亿美元，到2008年达到362亿美元。1996-2010年，生物技术为发展中和发达国家带来了同样的累积经济效益（均为390亿）在农业生物技术方面：集中在大豆、玉米和棉花上。第一阶段：抗病虫和耐除草剂；第二阶段：提高作物的品质。比如：全球第一例转基因食品calgene公司的延熟番茄（1993）；抗玉米螟的转基因玉米，抗棉铃虫的棉花、耐除草剂的大豆等。在美国，经GM修饰或改造的作物或食品，1999年已达7000万英亩，目前大约有50大豆、33棉花、大量的玉米、少量的马铃薯、油菜和南瓜均是GM。中国：1986年启动“863”高技术规划的提出，农业生物技术列为优先发展项目。（植物组织培养技术，特别是茎尖脱毒快繁技术）1995年，掌握了转基因植物的全套技术，包括目标基因的分离、克隆、Ti质粒介导的表达载体的构建及目标基因表达的检测。由于基础研究较弱，加上投资强度较低（35亿人民币/5年）,“七五”、“八五”、“863”计划中的相关部分的主市调只能是：跟踪、模仿和引进。展望1. 关于植物的繁殖（方式、速度等）； 2.关于动物的繁殖与性别控制（数量、性别）； 3.动物克隆：克隆绵羊Dolly（英国罗林斯研究所），克隆印度野牛（濒危物种 ）；4.生物反应器研究：美国开发了可生产人凝血酶原III的转基因羊；我国自行研制表达人凝血因子的转基因山羊（治疗血友病）；英国PPL制药公司也培育出可制造人胰蛋白酶抑制剂基因的克隆羊，在羊奶中能产生胰蛋白酶抑制剂，可用于治疗人类的哮喘病和肺气肿；荷兰制药公司制备了可大量生产人乳铁蛋白和促红细胞生成素（EPO）的转基因牛。5.动物或人体器官的复制（用于器官移植）： 目前人造皮肤和人造耳朵已经成功，都是利用皮肤细胞进行培养得到的。人类角膜、心脏肺瓣、血管、耳、胰脏、肌肉、乳房组织替代物等工程化组织均已能在实验室里生长。植物生物技术的发展简史1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt的早期尝试。 在论文中描述了培养细胞的生长情况，但没有观察到细胞的分裂增值。1904年，Hanning进行幼胚培养获得小苗（萝卜，辣根）；1922年，Kotte和Robbins（Haberlandt的学生），培养豌豆和玉米的茎尖培养，形成根和缺绿的叶片，可进行有限的生长（部分成功）；1933年，李继侗发现胚乳对胚培养的促进作用（银杏） ；1934年，Gautheret培养形成层，获得愈伤组织（山毛榉、黑杨）；同年，White培养番茄的根尖细胞，建立了第一个能够活跃分裂的单细胞无性系（28年，1600代），系统研究了光照、温度、pH、培养基组成对培养物的影响；1937年，White发明了第一个人工合成培养基；1937-1939年，愈伤组织的继代培养获得成功（胡萝卜，烟草）；1943年，White重新提出“植物细胞全能性”学说，出版了植物组织培养手册，标志着植物组培技术的建立，被誉为“植物组织培养之父”；1948年，Skoog和崔澂发现腺嘌呤对烟草茎段培养物的芽的形成有诱导作用（腺嘌呤/IAA）；70年代以后，原生质体培养、原生质体融合的研究形成热潮80年代以后，基因克隆、遗传转化的研究更是如火如荼，在许多方面取得了令人瞩目的成果1973年，重组DNA技术诞生，植物基因工程始于20世纪80年代（Monsanto公司） 。Fraley1984年在Science 发表“利用农杆菌来转移外源DNA至白花丹叶烟草原生质体中”。表明：定向改造植物成为可能。在农林产业中的应用农业科学A、 良种繁育及脱毒苗木。B、种质资源的保存。C、育种上的应用。分子育种细胞育种 第二章 细胞工程原理细胞工程: 指在细胞整体水平或细胞器水平上研究开发、利用各类细胞的工程，即人们根据科学设计，改变细胞的遗传基础，通过无菌操作、细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织培养和细胞培养等方法，改变细胞内的遗传物质以快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技术。细胞工程的研究内容:动、植物细胞与组织培养、细胞融合、染色体工程、胚胎工程、细胞遗传工程植物细胞工程：是指通过细胞培养、融合等细胞水平的操作，以及包含有多细胞的植物结构离体培养或操作，实现以细胞全能性为基础的改良种质或生产生物产品为目的的技术体系。植物活细胞的生命特征:新陈代谢 应激性 自体复制离体细胞的生命特征:培养细胞具备新陈代谢特性 、培养细胞具备应激性、培养细胞可以展现自体复制特性培养基提供的营养物质包括碳水化合物、无机氮和有机氮、其他矿物营养、维生素等。水无机营养物（无机盐）碳源维生素生长调节物质有机附加物琼脂活性炭抗生素水：培养基中大部分是水它使细胞质呈胶体状态，活化状态也是细胞中各种生理、生化反应的介质起着维持细胞一定渗透压与膨压的作用并为植物机体提供氢、氧元素配制培养基时，一般用蒸馏水或去离子水，使水中少含或不含某些离子。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素是指氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、氯(Cl)和镁(Mg)。它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。微量元素是指铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、钴(Co)、钼(Mo)、铜(Cu)等，其需要量很少，大多为10-510-7mol/L，稍多则产生毒害。碳源：外植体光合作用的能力低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1-5(可维持的渗透压范围在-152至-415kPa蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3:1-3:2，约有1/4至2/5的蔗糖用于保持培养基的渗透压维生素类与植物体内各种酶的形成有关维生素类的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主使用浓度一般为0.1-1.0mg/L，其中以维生素盐酸硫胺素(Vit.B1)、盐酸吡哆素(Vit.B6)、烟酸（Vit. B3)、Vit.B12、泛酸钙(Vit.B5)、生物素(Vit.H)及维生素C最常用。肌醇(环己六醇)本身不促进外植体生长，但可能有助于活性物质发挥作用；培养基中的肌醇用量为50-100 mg/L。培养基中重要的有机氮源甘氨酸(Gly)、 丝氨酸(Ser)、 酪氨酸(Tyr)、 谷氨酰胺(Gln)、 天冬酰胺(Asn)等甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用生长素主要作用：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生常用：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)作用强弱顺序为：2,4-DNAAIBAIAA有不同的适宜浓度细胞分裂素：主要作用：促进细胞的分裂和器官分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。常用：激动素(KT)、6-苄基腺嘌吟(6-BA)、玉米素(ZT)、2-异戊烯腺嘌呤(2-iP)、吡效隆(4PU，CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。强弱顺序为：TDZ4PUZT2-iP6-BAKT琼脂：琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢在植物细胞与组织培养中一直被作为首选固体培养基质而广泛应用用量一般在0.61.0当培养基pH值偏酸时，则琼脂用量要增加灭菌时间过长、温度过高均会影响其凝固活性炭：主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响可以防止酚类物质引起的组织褐化死亡，这在兰花组织培养中效果更明显活性炭使培养基变黑，有利于植物生根活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应既吸附有害物质，也吸附有利物质，如植物生长调节物质、培养基成分降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固不宜过浓，以0.1-0.5为宜抗生素：主要目的：防止外植体内生菌造成的污染。 常用的抗生素：青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素和庆大霉素等，用量一般为520mg/L。大部分抗生素要求过滤灭菌。总体来说，在高等植物离体培养中，特别是在商业性快速繁殖中，应当尽量避免使用抗生素!培养细胞的分化与形态发生脱分化：是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。启动阶段：细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现。 演变阶段：细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体。脱分化终结期：回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。 影响脱分化的因素：机械损伤、培养细胞的异质性、生长调节剂、光线再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程（现象）称为再分化。导管分化及其影响因素：离体条件下，导管分子由愈伤组织薄壁细胞分化形成，是愈伤组织细胞分化器官的前提。 生长调节剂。 生长素对维管组织分化过程有显著影响。 细胞分裂素对木质部分化的影响，主要表现在对生长素起协调和增效的作用。 生长素对维管组织分化所起的作用，很大程度下取决于糖的存在。低浓度生长素条件下，愈伤组织形成木质分子和韧皮分子的相对量，随蔗糖浓度变化而变化。细胞分化过程及其机理：极性：指植物的器官、组织，甚至单个细胞在不同轴向上存在某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。极性是植物细胞分化中的一个基本现象。导管分化的一个重要环节是细胞壁的形成。生长调节剂是导管分化的启动者，通过它和糖等其他因子的协同配合，诱使细胞内部的RNA和蛋白质物质代谢发生变化，PAL酶活性增强，导致木质素的沉积。木质素沉积的过程中，细胞壁加厚，原生质自溶，细胞核和细胞器消失，细胞骨架呈网状螺旋排列，整个细胞变成管状细胞。在整个植物体内或愈伤组织中，此时导管细胞长轴两端穿孔与另一细胞连通，进一步形成完整的输导组织，完成导管分子的分化。拟分生组织：又称分生组织结节，是指培养物中出现的类似分生组织的细胞群，它是由脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团细胞组成的。这些细胞体积小、薄壁、液泡小、细胞核和细胞质染色较深，它们具分化上的可塑性。器官分化：培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官的过程。离体条件下，器官分化是在人工辅助调节下完成的。器官分化过程不通过愈伤组织：外植体已存在器官原基，进一步形成组织器官植株或外植体某些部位的细胞，重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基完整植株的形成：胚胎发生和器官发生 植物的体细胞胚胎发生是指双或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。体细胞胚胎的发生来源外植体直接发生二倍体胚、愈伤组织产生胚状体、悬浮细胞产生胚、单倍体胚胎发生原生质体发生胚状体培养细胞变异的遗传机理：细胞异常有丝分裂、染色体断裂、DNA核内重复复制、核基因突变、转座子的活化 第三章原生质体技术原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体胞质体：含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。原生质体的研究进展1、1863年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。2、1892年，Klercker用刀片细切植物组织机械分离出原生质体。3、1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。4、1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。5、1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。6、1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 叶片经典材料。 自从1971年Takebe等利用烟草叶肉组织成功分离出原生质体并使其再生植株以来，利用叶片分离原生质体已被广泛应用。 一般可能认为选取细胞分裂旺盛的生长点附近的嫩叶较为合适，但是，许多试验结果表明，选用充分展开的成熟叶片或生理活性稍稍衰退的过熟叶片，有利于原生质体的分离及其后的培养。处理：在叶片取材之前，通常先对供体植株进行适当的干旱处理使其处于轻度的萎蔫状态。也可以对离体叶片的切块先进行质壁分离，这样分离原生质体的效果更好。 材料预处理对于某些植物非常重要。 分离得到的原生质体，其活力和分裂频率高低是影响原生质体培养成功的2个决定性的因素。 在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。 例如 龙胆试管苗的叶片只有用4低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。 原生质体的收集与纯化概念：酶解液中，有完整的原生质体、破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其它碎片。同时，还含有酶及其它不利于原生质体培养、再生的试剂。 这些在原生质体培养中会引起干扰作用，必须清除，这一过程称为纯化。即从酶解液中获得纯净原生质体的过程。方法：先滤除组织碎片和残渣，再以新的渗透压稳定剂或原生质体培养基离心洗涤2-4次。主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。原理：采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。1、将含有原生质体的酶液混匀，通过孔径44-169 m的筛网过滤（孔径大小因植物种类而异），除去组织碎片和残渣。2、将滤液与高渗溶液混合，在900-4500r/min下离心，弃上层碎片溶液，小心吸取中层原生质体。重复2-3次。优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。缺点：由于高渗溶液对原生质体常有破坏，因而完好的原生质体少。原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，不能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件：酶活力和纯度浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：纯化方法、离心次数、离心速度、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 原生质体培养基：无机盐、大量元素浓度；MS或B5中NO3和NH4+的比例，应适当降低。Ca2+浓度高浓度有利于原生质体或再生细胞的分裂。 有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素 常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D 渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 固体平板培养固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在30C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。 优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点：是操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。影响原生质体培养的因素 基因型 通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定的。Cheng和Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所控制(Cheng et al., 1991)。培养成份Ca2+ , NH4+渗透稳定剂培养密度：105个/ml。低密度条件下，细胞代谢产物扩增到培养基中影响细胞内浓度。PEG融合： PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG(聚乙二醇)分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。电融合法： 原理：当原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入电极，接通一定的交变电场。在电场中，原生质体极化后顺着电场紧密接触成珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体膜被击穿而发生融合。 与PEG融合比较，电融合有三大优点： 不使用有毒害的试剂，作用条件温和，不存在对细胞的毒害问题、 融合基本上是同步发生，融合效率高、融合技术操作简便。原生质体的融合过程膜的融合、 细胞质融合: 发生膜融合后的数小时 、核融合:融合可能发生在细胞间期，也可能发生在第一次同步分裂过程中 。影响原生质体的融合因素融合方法融合参数：包括各种融合液都应选择适当以及电压和电流等。原生质体质量：对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的先决条件。细胞杂种的选择方法有： 外观选择：质体、细胞体积等 互补选择：抗生素、营养缺陷型等 荧光标记选择：亲本标记不同荧光 体细胞杂种植株的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 第四章 基因工程原理1，基因的表达：基因mRNA 肽链蛋白质性状,基因：一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。 基因工程：“在细胞外，把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内无性繁殖获得成功”的工作内容。2基因工程理论依 ：不同基因具有相同的物质基础。基因是可以分离的。基因是可以转移的。多肽和基因之间存在对应关系。遗传密码是通用的。基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。3基因与DNA的关系：具有遗传效应的片段。基因功能：决定生物性状的基本单位基因与染色体的关系：在染色体上呈直线排列。染色体是基因的主要载体。4基因的传递规律：1，核基因遗传:基因分离定律、基因自由组合定律；质基因遗传：细胞质遗传，2核基因变异:基因突变、基因重组；质基因变异：基因突变5麦克林托克，1951年提出了可移动的遗传基因（即“跳跃基因”）学说基因可从染色体的一个位置跳跃到另一个位置、甚至从一条染色体跳跃到另一条染色体，为研究遗传信息的表达与调控、生物进化与癌变提供了线索。18561864年，奥地利遗传学家孟德尔（G.Mendel）“豌豆试验”，提出遗传因子概念，独立分配率。1910年，美国遗传学家摩尔根（T.H.Morgan）“果蝇试验”，遗传性状的连锁定律、互换定律，创立了遗传的染色体理论二、基因工程的准备阶段1、理论上的三大发现生命的遗传物质是DNA（细菌转化实验；噬菌体感染实验）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）2、基因工程研究简史技术上的三大发现限制性内切酶和DNA连接酶的发现。（标志着DNA重组时代的开始）载体的使用。1970年，逆转录酶的发现。3、DNA重组 是根据人们的愿望，进行严密的设计，在生物体外通过人为的DNA片段化和重新连接，产生新的重组DNA分子，使遗传信息发生变化，达到基因重组等预期目标。4、一般来讲，基因工程研究应包括6个主要内容或步骤：（1）分离：从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，分离带有目的基因的DNA片段。（2）连接：在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制，并带有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。（3）转化：通过细胞转化手段将重组DNA分子转移到适当的受体细胞。（4）增殖：培养转化细胞，获得大量的细胞繁殖群体。（5）检测：筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆，并从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已经得到扩增的目的基因，做序列分析等鉴定。（6）表达：将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达。三、基础研究克隆载体：原核生物克隆载体，Ti质粒，动物病毒克隆载体克隆载体：通过不同途径能将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。受体系统：原核生物（大肠杆菌、蓝藻）和真核生物（酵母菌、植物、生殖细胞、人的体细胞）受体系统：是克隆载体的寄主，是外源目的基因表达的场所人类基因组计划： 23对染色体、3109核苷酸对、编码至少10万个基因。 1990年，人类基因组计划在美国正式启动。 1999年，中国获准加入人类基因组计划，承担1%的测序任务，成为参与这一计划的惟一发展中国家。 2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。 1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的“聚合酶链式反应(PCR)”技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。二、应用研究 基因工程药物：基因工程活性肽、基因工程疫苗、DNA药物 转基因植物：抗病虫害、抗除草剂、抗逆性、改善植物品质转基因动物：改良家畜、家禽和鱼的经济性状、通过转基因动物生产某些药物和蛋白质 其他：酶制剂、食品、化学与能源、环境保护 第五章 基因重组及表达调控一、基因与基因组1、DNA的结构 碱基组成：A T C G 碱基互补原则 结构：双螺旋结构表示方法：单链5-3 DNA的变性、复性 DNA的存在形式：线性、环状、开环2、DNA的功能（1）DNA分子能在细胞内复制：半保留复制，复制起始点，复制子 ，原核生物是单复制子，真核生物是多复制子（同一代细胞的增殖，生殖） （2）携带遗传信息：发育3 、基因的结构A、原核生物的基因结构：RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质 。编码区: 能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质 。B、原核生物结构基因组成 转录启动子、基因编码区、转录终止子。 启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。 转录起始位点：转录mRNA的第一个碱基，多数是A，以此作为序列的1，其上游核苷酸序列为“一”，下游核苷酸序列为“”。 基因编码区：包括起译码ATG、开读框和休止码TAA（TAG、TGA）。 终止子：提供转录停止信息的核苷酸序列。C、真核生物的基因结构外显子：能够编码蛋白质的序列叫做外显子。 内含子：不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子不能转录为成熟的信使RNA。D、真核生物结构基因组成 基因单独存在，两个基因之间有很长的间隔序列区。内含子、外显子。 转录启动子有3个保守序列区：20-30：TATA框，DNA在此处开始解链； 70：CAAT框，RNA聚合酶结合。 更上游：GC框，转录调控因子结合。 终止子下游有一保守的AATAAA提供转录产物的释放信号。 不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5端添加的“帽”结构。4、基因组 基因组(genome)：一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和。 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3109(30亿bp)，共编码约10万个基因原核生物基因组与真核生物基因组（1）基因组DNA分子量小。主体为单个环状染色体，仅一个复制起点。重复序列少。不编码的DNA序列少。广泛存在操纵子结构。（2）真核生物具有真正的核结构核一定数目的染色体。真核生物基因组远大于原核生物，具多个复制起点。大部分基因具有内含子。非编码序列量多于编码序列。存在大量重复DNA序列。未发现原核生物的操纵子结构5、染色体结构 染色体包括：DNA和蛋白质二、基因的转移和重组1 、基因的转移 ：细菌的接合 细菌的转化 转导 转染 转座 细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。 转化因子本质是DNA。 感受态：细菌生长过程中，只有某一阶段的细菌才能成为转化的受体的生理状态。一般细菌的感受态都出现在对数生长的后期。 转化因子整合相关因素：受体细胞的感受态、受体与供体DNA的同源性、受体细菌的酶系统、线状供体DNA较环状DNA易转化。 转导：以噬菌体等为媒介把细菌的基因从一个细胞转移到另一个细胞的过程。 烈性噬菌体由于不发生整合所以不会发生转导。 转导分为普遍性转导和局限性转导。转染：噬菌体侵入细菌或外源DNA导入真核细胞的过程 转座因子：又叫跳跃基因或移动基因，是一种可以在染色体基因组上移动，甚至在不同染色体之间或是染色体、噬菌体及质粒DNA之间跃迁的DNA短片段。2、同源重组和非同源重组（1）同源染色体交换 1964年，哈利台（R.Holliday）提出的链断裂重接模型，解释了部分杂合双链的产生。步骤：链断裂：同源联会的两个DNA分子中任意一个出现单链切口，切口由DNA内切酶完成。 两个单链对接，形成半交叉。 半交叉位置移动。 Holliday中间体的变构和拆分。 （2） 非同源重组 非同源重组是指发生重组的两个DNA分子之间没有或较少有序列同源性且不依赖重组蛋白RecA，这样转座、质粒的转化、噬菌体、动物病毒的整合均属于非同源重组。非同源重组又分为复制性重组（重组后原来位置结构不消失）和保守性重组（原来位置结构消失）。三、基因的表达调控1、基因表达：指基因所编码的遗传信息被转化为蛋白质产物。基因表达的主要过程包括基因的转录和mRNA的翻译。基因表达的调节控制，简称基因表达调控，是指各种生物对其携带的遗传信息表达的精密控制。在原核基因的表达过程中，转录和转译是偶联发生的；在真核基因表达过程中，转录和转译在空间和时间上都是分开进行的。 2、乳糖操纵子结构基因：在乳糖操纵子中，与乳糖利用有关的三个酶半乳糖苷酶、半乳糖苷透性酶、半乳糖苷转乙酰酶的基因。 在结构基因上游为共同的调节基因（i）、启动子（p）和（o）操作子。 抑制因子：在没有乳糖的情况下，调节基因产生的阻遏蛋白，以四聚体的活性形式与操作子结合色氨酸操纵子弱化作用：是指转录在没有进入第一结构基因时便终止。3.2 真核生物的基因表达调控 DNA水平的调控：染色质丢失，基因扩增，基因重排 染色质结构与基因表达的关系 转录水平的调控：顺式作用成分，反式作用因子 转录后水平的调控 翻译调控：蛋白质翻译起始的调节作用，mRNA寿命与翻译调节 翻译后的调控：蛋白质产物的切割加工，蛋白质的化学修饰 第六章 基因工程酶学基础1. 酶的主要用途： 限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链；3 填补双链DNA 3凹端；4 DNA测序。Taq DNA 聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基 2.核酸酶： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。3.核酸内切限制酶（限制性内切核酸酶） 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。4.限制-修饰系统限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统5.核酸内切限制酶 分类（1） 型限制性内切酶 功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；应用：不常用。（2） 型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。即通常所指DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；应用：种类繁多，分子克隆中最为常用（3） 型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3端24-26 bp处。应用：数量很少，无实际作用。6.核酸内切限制酶基本特点： 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构； 切割产生末端有粘端 和平端7.核酸内切限制酶 其他分类方式：（1）同裂酶:识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶。(2) 同尾酶一些来源不同、识别的靶子序列也不相同，但却能产生出相同的粘性末端.8. 杂种位点: 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。9. 核酸内切限制酶 连接方式: 分子间的连接 和 分子内的连接10.核酸内切限制酶 活性影响因素： DNA模板的纯度 DNA的甲基化程度 酶切反应温度 DNA的分子结构 缓冲液11. 核酸内切限制酶的星号活性 限制酶的星号活性：即star活性或星星活性。是指在酶反应条件发生改变的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。12. 产生星号活性的因素： 酶单位数/DNA比值过高，超过10u/mg DNA，就会产生星号活性；甘油浓度过高(超过5%)；二价离子的改变，如果反应体系的Mg2+被Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+代替，EcoRI和Hind等均会出现星号活性；低离子强度8)有机溶剂，如DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基甲酰胺等。13. DNA连接酶： 定义：可使一段DNA 3-OH末端和5-P 末端形成3,5-磷酸二酯键，把两DNA片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。14. 裂口：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。15 缺口：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯链。16 DNA连接酶 分类及其作用 （1）DNA连接酶：连接粘性末端（2）T4连接酶：连接平末端和粘性末端17 DNA连接酶的连接作用：A. 粘性末端DNA片段的连接B. 平末端片段的连接18.常用的DNA聚合酶 ： 大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片 段酶 、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7 DNA聚合酶、反 转录酶等。19. DNA聚合酶的定义：能够根据DNA模板合成互补DNA的核酸酶20DNA聚合酶 I 活性：53聚合活性，53外切和35 外切活性。发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3-端游离羟基的引物链（3）底物和激活剂21. Klenow聚合酶： 活性： 53聚合活性，35 外切酶活性，无 53 外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定22. Taq DNA聚合酶： 显著特点：热稳定性。70反应2h残留活性90 %； 93 反应 2 h残留活性60% ；94 反应 2 h残留活性40%。应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。23. 逆转录酶： 又称RNA指导下的DNA聚合酶。 活性： 53聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是 RNA或DNA，引物是带3-OH的RNA或DNA。用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针24. T4 DNA聚合酶： 活性： 53聚合酶活性和35外切酶活性，且35外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。 应用：标记DNA平末端或隐蔽3末端25. T7 DNA聚合酶： 活性：53聚合酶活性；有单链及双链的35外切酶活性，但无53外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA 3末端；（3）使双链DNA 5或3突出末端变平末端。26.末端转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶（是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量（34103dal）的碱性蛋白质。末端转移酶用途：(1) (主要)给外源DNA片段和及载体加互补同聚物尾巴；(2) 标记DNA片段的3末端。27. 碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌或小牛肠该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。28. 核酸外切酶：定义 是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 按作用特性的差异，可以分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。前者包括大肠杆菌的核酸外切酶（exo ）和核酸外切酶 （exo ），后者包括大肠杆菌外切酶 （ exo ）、 噬菌体核酸外切酶（ exo ）以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等。 第七章 基因工程常用载体1. 载体：将外源DNA或基因携带入寄主细胞的工具。载体类型：质粒 噬菌体 噬菌粒 粘粒 特点： 在寄主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）。 必须具备合适的酶切位点供外源DNA片段插入，同时不影响复制。 有一定的选择标记，用于筛选。 有一定的拷贝数，便于制备。2. 质粒的一般生物学特性：A染色体外的遗传因子，能自我复制B大多数为双链、闭环DNA分子，少数为线性C大小1kb-200kb，也有更大3质粒编码的表型：抗菌素的抗性产生抗菌素的基因 降解复杂有机化合物产生毒素 限制与修饰固氮 杀虫4.显性质粒（表达型质粒）：某些质粒除了有与控制本身复制和转移相关的基因外，还携带一些其它基因，寄主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状。5.隐蔽质粒：寄主含有某种质粒，但无异样性状表露。这种质粒为隐蔽质粒。6.氨苄青霉素抗性基因 AmpR ampr ampicillin作用：青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。 四环素抗性基因 tetr tetracycline作用：四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。氯霉素抗性基因 CmR Catr chloramphenicol作用：氯霉素与50S亚基结合并抑制蛋白质合成卡那霉素和新霉素抗性基因 Kanamycin/Neomycin作用：可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉素胺氮基糖苷。7. 常用的质粒载体 克隆载体：用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。8. 噬菌体 的基本功能： 保护自己的DNA或RNA免遭环境化学物质的破坏。 将其核酸分子注入到感染的细菌细胞。 将被感染的细菌细胞转变制造噬菌体体系，从而能产生大量的子代噬菌体颗粒。使被感染的细胞释放出子代噬菌体颗粒9.噬菌体生命周期 的基本过程： 吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上。 注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入细胞 转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化成为制造噬菌体颗粒的场所。 合成：功能发生改变了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。组装：包装了DNA的头部和尾部组成噬菌体的颗粒，这个过程也叫做噬菌体的形态建成。释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。10. 原噬菌体：溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。11. 原噬菌体主要特征： 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 经过短暂的转录期之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭。 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。 细菌继续生长、增殖、噬菌体的基因作为染色体的一部分进行复制。 12.粘性末端：噬菌体的基因组是由双链DNA组成，其线性分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。13.cos位点：注入感染寄主细胞内的lDNA线性分子，会迅速环化形成双链DNA分子。这种由粘性结合形成的特定的双链区段14. 插入型载体：有插入型载体和置换型载体。通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体15置换型载体：允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体16. 噬菌体载体主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库。17. 基因文库：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。18. M13的增殖： 吸附/入侵/F菌株的性纤毛，D