利用不同的方法筛选和鉴定转化子.doc

生物工程上游技术实验综合实验设计利用不同的方法筛选和鉴定转化子 摘要本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，采用A mp抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。关键词菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定引言在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割 大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。一、 实验目的通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。二、 实验原理通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致. 三、使用仪器、材料1、材料实验九准备好的菌株。2、设备用具PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。3、主要试剂PCR： 10 PCR buffer 、rTaq 酶dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM引物(2.5M) P1 ：GFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 (Tm=65.5) (Sal I) P2:GFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3 (Tm=61.5) (Xba I) 1.5% 琼脂糖凝胶 配制LB液体培养基： 称胰蛋白胨0.2g，酵母提取物0.1g，NaCl 0.2g于100ml的三角瓶中，加入20ml蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH调pH至7.5，加塞，包扎瓶口。质粒提取：溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含RNA酶（RNaseA）: 20 g/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇限制性核酸内切酶：Sa l I和 RcoR I 10H buffer 苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、 无水乙醇、70%乙醇等四、 实验步骤（一）转化子的筛选取连接反应转化原液100uL，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。倒置平板于37继续培养16个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。（二）菌落直接PCR 用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落,在编好号码的PCR反应管中的底部分别涂抹,然后在PCR管中配制15L反应体系.10 x PCR buffer 1.5l dNTP mixture 1.2l 前向引物 (P1) 2.4l 反向引物 (P2) 2.4l rTaq酶 0.15l 灭菌蒸馏水 7.35l 所有试剂加完后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加10l矿物油覆盖。PCR仪的参数设置琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。 （三）重组质粒的大小鉴定根据电泳结果，用无菌牙签从平板上挑选PCR反应阳性菌落,接种于含Amp 100g/mL的10mL LB液体培养基中,37下震荡培养12个小时。质粒的提取：1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复12次）。3) 加入150 L 溶液，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4) 加入200 L溶液，加盖后温和颠倒56次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5) 加入150 L预冷的溶液，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6) 离心(14 000r/min，4，5min)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4，5min)，溶液将出现分层。8) 移取上层水相溶液（约450500L）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10) 离心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 min，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥.13)加2030L TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20保存备用。14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5L溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15) 每位同学各取5L质粒DNA加入1L 6loading buffer，混匀，进行点样。16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。（四）重组质粒的酶切鉴定 DNA浓度纯度的测定 空白测定：吸取200 l蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。DNA测定：取质粒DNA 1 l至一干净的离心管，加入199 l蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。酶切反应酶切反应液的配制: Sal I 1l 10H buffer 2l RcoR I 1l 质粒DNA 5l ddH2O 到 20l 酶切反应条件：37水浴23小时。电泳检测 反应结束后，向反应液中加入2l 10loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22l样品均点在一个点样孔。电泳条件：100V, 20分钟左右。四、 实验结果图一 挑取进行PCR反应的平板菌落图二 菌落直接PCR电泳图 图三 摇瓶培养的阳性菌落图四 提取质粒电泳图和酶切鉴定电泳图五、 实验结果分析图一是Amp抗性筛选培养基，上面长出的菌落是转化子菌落。菌落呈白色、光滑、圆形形状。每个培养基各挑选5个菌落的菌种做PCR反应，挑选的菌落都是比较大的、清晰的、周围菌落干扰比较少的，并用油性笔在上面做110号标记，方便之后接种辨认。图二是菌落直接PCR反应后的电泳图。图中最右边是marker。可以看出，图中标出的、号泳带扩增出特异性条带，而且比较明亮、清晰，大约为750bp到1000bp之间，与EGFP片段理论值相符，表明这五个菌落的菌PCR结果为阳性，说明第1、2、4、5、6号菌是所需鉴定的重组子。图三是取PCR阳性反应摇瓶培养后的照片。由于1号菌的条带相对比较弱，因此只选取了2、4、5、6号菌摇瓶培养，图中显示菌种成功培养出来，摇瓶培养成功。图四是质粒提取和酶切鉴定的电泳图。图中右边数起第一条是DL2000的marker电泳带，第二条是DL5000的marker电泳带。号泳道是质粒提取的电泳带，是酶切反应的电泳道，两组电泳道依次对应2、4、5、6号菌。质粒提取的电泳图中，号电泳带有三条带条带，从下往上数，分别是超螺旋DNA，线性DNA和开环DNA。，因为共价闭合DNA是完整的，构型比较紧密，阻力比较小，所以跑的最快，线性DNA是环状的双链DNA两条链均断开了，其分子构象变化，不如共价闭合的紧密，所以跑的慢点。开环DNA是环状双链DNA有一条链断开，拖着一条尾巴，显得很臃肿，阻力最大，所以跑的最慢。电泳带都大约位于2000bp，符合理论质粒大小。且条带比较暗，说明质粒的量比较少，而杂质偏多，而检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。可能是因为蛋白质残留和实验过程中震荡多于大力损坏了质粒。检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。酶切鉴定反应中，、号电泳带有清晰的三条带，、号泳带只有两条泳带。在酶切反应中，pET32-CaM5质粒有两个酶切位点，完全酶切应得到两个片段，分别为6131bp和219bp。、号泳道中，最上面的电泳带大约在6130bp处，第二条大约在219bp处；、号泳道中，电泳带大约在6130bp处，符合理论值，说明、号泳带的菌种，也就是第4、6号菌是阳性，是pET32CaM5转化子。、号泳带的菌种，也就是2、5号菌是假阳性。但是电泳图中出现第三条带，说明蛋白质杂质和已降解的DNA.有点多，操