妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的研究.doc

妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的研究【关键词】 妊娠人类妊娠是一个复杂而又需机体各部分协调运转的过程。子宫肌层由静息到收缩的机制很复杂，目前还在探索中。妊娠期众多激素的变化引起人们广泛的关注，其中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）近年来成为人们关注的焦点。CRH是脑肠肽家族中的一种，于1955年最早发现于下丘脑室旁核，之后在许多外周组织中，如免疫和炎症细胞、心脏、骨骼肌、甲状腺、皮肤、生育组织中发现了它的存在13。胎盘是妊娠期母体CRH的主要来源。人们发现母体血浆CRH水平随着妊娠继续而逐渐升高，分娩前达到高峰，产后迅速下降；早产患者的CRH峰较正常妇女提前，提示母体血浆CRH水平与分娩密切相关4。CRH可能通过与雌激素、肾上腺皮质激素、前列腺素和缩宫素等的相互作用，建立分娩启动的正反馈环2，5。在妊娠子宫宫底部CRH发挥收缩作用，而在下段舒张子宫平滑肌，这可能与受体和（或）传导通路不同有关6，7。本研究通过对子宫下段平滑肌层中CRH受体和（或）亚型的研究，进一步揭示CRH在分娩过程中的作用机制。1 对象与方法1.1 研究对象 （1）宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、已有宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均27.55（2436）岁。（2）无宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、无宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共14例，平均30.64（2541）岁。（3）未妊娠组：随机抽取因子宫肌瘤行子宫切除患者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均46.59（4054）岁。1.2 主要试剂与仪器 无水乙醇（上海试剂一厂），三氯甲烷、异丙醇（中国医药上海化学试剂公司），焦炭酸二乙酯（DEPC）、Trizol（上海华舜生物公司），dNTP、Oligo(dT)（上海生工生物工程有限公司），M-MLV反转录酶、Tap DNA聚合酶（Promega公司），核糖核酸酶抑制剂（TaKaRa公司），Milli-Q纯水制备装置（Millipore公司），PCR仪（Eppendorf公司），DNA电泳槽（WEALTEC公司）。1.3 主要溶液的配制 （1）DEPC-H2O:双蒸水1000ml加DEPC 1ml，37摇动过夜，然后高压灭菌。（2）75%酒精：125ml DEPCH2O加 375ml无水乙醇，混匀至终体积500ml。（3）50TAE电泳缓冲液：Tris 242g、100ml 0.5mol/L EDTA（pH=0.8），加冰醋酸57.1ml，用蒸馏水定容至1000ml，临用前按需用蒸馏水稀释成1倍的工作液。1.4 研究方法1.4.1 子宫标本的收集 （1）于子宫下段切口正中上缘切取适量新鲜子宫肌层标本放入经过DEPC水处理的10ml离心管（冰中）内；（2）每个离心管内加入2ml Trizol；（3）于1h内用电动匀浆机匀浆（冰浴中操作），26000rpm持续15s以彻底裂解组织；匀浆液于-80保存，待提取RNA。1.4.2 总RNA的提取及浓度测定 （1）总RNA的提取：按照上海华舜生物公司Trizol Reagent操作说明书进行。室温溶解组织匀浆液：将组织匀浆液1ml移至1.5ml离心管，室温静置8min；各管加入0.2ml三氯甲烷；用力颠倒混匀，室温静置8min；4，12000g离心15min；将上清液小心移至另一个1.5ml离心管；各管加入等体积异丙醇，振荡，室温静置10min；4，7500g离心15min；小心弃上清液，各管加入75%乙醇1ml；充分洗涤，4下7500g离心10min；弃上清液，空气中干燥1520min；各管加入20l DEPCH2O溶解RNA。（2）总RNA纯度和浓度测定：采用紫外分光光度法，测定RNA样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据OD260为1时相当于RNA 40g/ml确定RNA的量，根据OD260/OD280的比值来判断RNA样品的纯度，比值位于1.82.0之间视为RNA纯度优良。总RNA抽提后，行RNA甲醛变性凝胶电泳，观察18s、28s RNA的完整性及二者比例，来判断RNA的完整性。1.4.3 RTPCR方法 （1）反转录（reverse transcription,RT）：按照Promega公司反转录酶MMLV操作说明书合成cDNA第一链：取2g总RNA和1g Oligo（dT）分别放入同一个1.5ml离心管中；70水浴5min；冰上急冷3min；各管分别加入10mM dNTP 1.25l、MMLV 1l、RNA酶抑制剂0.75l、反转录缓冲液5l；用DEPCH2O补齐至总体积为25l，震荡、混匀后，离心；42水浴60min；70水浴15min；-20保存备用。（2）PCR反应：利用PCR引物序列CRHR1（sense：5TCCGCTACAATACCAACAA,antisense:5GCCGCAGAAAGAGGACAAA,扩增产物理论值约207bp）、CRHR2（sense:5AGAATGCTTGGAGAATGGGACG,antisense:5ACGACAAGGGCGATGCGGTA，扩增产物理论值约171bp）、gapdh（sense:5GACACCCACTCCTCCACCTTTGA,antisense:5CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC，扩增产物理论值约189bp），测定有宫缩、无宫缩及未妊娠子宫下段平滑肌CRH受体和（或）亚型mRNA的表达水平。（3）反应体系（25l）：dH2O 15.6l；10倍扩增缓冲液2.5l;25mM MgCl2 1.5l;10mM dNTPs 1l;10M引物11l;10M引物21l；cDNA产物2l。95 6min后，加0.4l TaqDNA聚合酶（5u/l）；95 30s;55（CRHR1）/58（CRHR2及gapdh）30s，72 1min，30个循环后，72 10min。1.4.4 实时PCR定量分析 采用浓度逐渐递增的子宫肌层细胞cDNA，作为相对已知浓度的cDNA，在实时PCR中分别作为CRHR1和CRHR2的标准品，同时扩增样本，应用Rotorgene5软件绘制标准曲线，以该标准曲线相对定量样本cDNA浓度，用CRHR1和CRHR2与GAPDH的相对cDNA浓度比值反映CRHR1 mRNA和CRHR2 mRNA表达量。1.5 统计学方法 所有数据均以中位数四分位间距表示。以SPSS 10.0软件进行ANOVA方法行两独立样本方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。2 实验结果2.1 子宫肌组织mRNA甲醛变性凝胶电泳 见图1。图1 子宫肌组织mRNA甲醛变性凝胶电泳略2.2 子宫肌组织gapdh RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图2。2.3 子宫肌组织CRHR1 RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图3。2.4 子宫下段肌组织CRHR2 RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图4。图2图5 略2.5 实时定量PCR结果 （1）未妊娠子宫肌中CRHR1 mRNA显著高于足月有宫缩、无宫缩子宫（P0.05）；足月妊娠有宫缩、无宫缩子宫肌中CRHR1 mRNA表达无明显差异（P0.05）（见图5）。（2）妊娠妇女子宫肌中CRHR2 mRNA水平较未妊娠时显著降低（P0.01）；足月有宫缩、无宫缩子宫肌中CRHR2 mRNA表达无明显差异（P0.05）（见图6）。图6 略3 讨论随着分娩启动机制的研究进展，人类生殖系统中CRH及其受体的研究越来越受到关注。CRH受体（CRHR）是一种G蛋白耦联受体。目前已知三种CRH受体：CRHR1（1h）3和CRHR2（2，2和2），2001年在二倍体catfish中发现了第三种CRH受体（CRHR3）8。在人类子宫肌层中发现有CRH R1和R2受体。胎盘中表达CRHR1，而不表达CRHR2 mRNA7。既往人们发现妊娠子宫中存在CRH受体1、1、2和变异的C9，非妊娠子宫中存在1和16。子宫下段CRHR1 mRNA妊娠期下降，分娩时显著升高；宫底无变化。CRHR1、CRHR2蛋白定位于未妊娠及分娩子宫平滑肌上。妊娠子宫中，CRHR定位于平滑肌及纤维原细胞中5，7。在本研究中，与未妊娠子宫相比，足月妊娠无宫缩、有宫缩子宫肌中CRHR1 mRNA、CRHR2 mRNA显著降低（P0.05）。妊娠期与非妊娠期子宫平滑肌CRHR1 mRNA与CRHR2 mRNA表达有显著差异，提示CRHR1 mRNA、CRHR2 mRNA与妊娠关系密切。妊娠期血浆CRH的升高，正调节子宫肌组织中的CRHR蛋白表达。CRHR蛋白的表达增加抑制子宫肌中CRHR mRNA的表达。研究证明CRHR mRNA表达下降是由环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate- protein kinase A, cAMP-PKA)旁路介导的转录后途径如mRNA降解引起的，与细胞外信号调节丝裂原激活蛋白酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）旁路无关10。有学者提出，CRHR1对CRH的亲和力比CRHR2强，CRHR2的配体是Ucn，而不是CRH，提示CRHR2不直接调节分娩时母体血浆CRH的变化7。总之，CRHR1和CRH、CRHR2和Ucn及它们与妊娠、分娩启动的联系及其作用机制尚待更深一步的研究。【参考文献】1 Timothy W Lovenberg, Derek T Chalmers, Changlu Liu, et al. CRF2 and CRF2 receptor mRNAs are differentially distributed between the rat central nervous system and peripheral tissues. Endocrinology,1995,136:4139-4142.2 Dimitris Grammatopoulos, Yalei Dai, Jing Chen, et al. Human corticotropinreleasing hormone receptor: differences in subtype expression between pregnant and nonpregnant myometrial. J Clin Endocrinol Metab,1998,83:2539-2544.3 Warrick J Inder, Timothy CR Prickett, M Jane Ellis, et al. The utility of plasma CRH as a predictor of preterm delivery. J Clin Endocrinol Metab,2001,86:5706-5710.4 Dimitris K Grammatopoulos, Edward W Hillhouse. Activation of pretein kinase C by oxytocin inhibits the biological activity of the human myometrial cortocotropinreleasing hormone receptor at term. Endocrinology,1999,140:585-594.5 Grammatopoulos DK, Hillhouse EW. Basal and interleukin1 betastimulated prostaglandin production from cultrued human myometrial cells: differential regulation by corticotropinreleasing hormone. J Clin Endocrinol Metab,1999,84:2204-2211.6 Alexander Pisarchik, Andrzej T Slominski. Alternative splicing of CRHR1 receptors in human and mouse skin: identification of new variants and their differential expression. FASEB J，2001，15:2754-2756.7 E Karteris, D Grammatopoulos, Y Dai, et al. The human placenta and fetal membranes express the corticotropinreleasing hormone receptor 1(CRH1) and the CRHC variant receptor. J Clin Endocrinol Metab,1998,83:1376-1379.8 E W Hillhouse, H Randeva, G Ladds, et al. Corticotropinreleasing hormone receptors. Biochemical Society Transactions,2002,30:428-43