冠心合剂减少大鼠心肌梗死边缘区凋_省略_Caspase_3蛋白.pdf

第 31卷 第 11期 中 华中医 对 梦刊 VoL 31N o ll 2013 年 11 月 CH INESE ARCHIVES OF T RA DITIONAL CHINES E MEDICINE Nov 2 0 1 3 冠心合剂减少大鼠心肌梗死边缘区凋亡及对 Fas FasL Cas p ase 8 C as p ase 3 蛋白表 达的影响 陈铁龙 祝光礼 赫小龙 齐国安 杭州市中 医院浙江中医药大学附属广兴医院心内科 浙江杭州 3100 07 摘 要 目的 观察不同剂量冠心合剂对大鼠急性心肌梗死边缘区细胞凋亡及探讨可能作用途径 方法 取 雄性SD大 鼠80只 随机分为模型组 冠心合剂高剂量组 中剂量组 低剂量组和对照组 连续灌胃 7 d后 结扎 冠状动脉左前降 支造成急性心肌梗死模型 对照组不 结扎冠状动脉左前降支 手 术后4 5 h 留取心脏标本 检测 梗死边缘区细胞凋亡以及Fas Fa8L Caspase 8 Caspa se 3蛋白表达量 结果 与模型组比较 冠心合剂组可明 显减少心肌细胞凋亡 并能减少Fa s FasL Caspase 8 Cas p ase 3的蛋白表达量 其中冠心合剂大剂量组减少心 肌细胞凋亡效果最明显 结论 冠心合剂能够保护缺血诱导的心肌细胞凋亡 其作用机制 Fa s FasL Cas p ase 8 C as p ase 3 蛋白表达水平有关 关键词 冠心合剂 急性心肌梗塞 凋亡 Fas F asL C as p ase 8 C as p ase 3 中图分类号 R332 文献标志码 A 文章编号 16 73 7 717 2013 11 245 3 03 Guanxin He j i Redu c in g Ap o p tos is in Ra ts with Acute M y ocard ial In fa rct ion a nd Ef fects on F as FasL C as p ase 8 Cas p ase 3 Ex p ress ions CHEN Tielon g ZHU Guan g li HE X ia olon g Q I Guo an Hangzhou H ospital of T CM Gua ngx in g H ospita l Af fi l iated to Zhe j ian g Ch in ese M edical Univ ers it y Han g zho u 310 0 07 Zhe j ian g Ch ina Abst ract O bje c tive T o inv estigate the ef fec ts of d ifferen t dosa g es of Guan x in H e j i on a p o p tos is in rats w ith acute m y o c ardial infarction and its p ossible mecha nism Me thods 80 ma le SD ra ts were random l y d ivided into 5 g rou p s mo del g rou p sham g rou p h igh dose gr o u p 28 g kg d G uanxin He j i p re trea tment m edium dose gr oup 14 g kg d Guan xin H e j i p re tr eatment low dose g rou p 7 g k g d G uanxin H e j i p re trea tment After be in g adm inistered corres p ond ing m ed icin e for 7 days all g ro u p s e xce p t sham g rou p underwen t coron ary li g a tio n of left an ter i or descendin g branch to establish a cute m y ocard ia l infarction mode ls a n d sham g roup o nl y re c e ived thora co tom y without c oronar y li g a tion Four and ha lf hours after acute m y ocardial infarc tion myocard ium tissues w ere co lle cted to dete ct the apo p totic index w i th T U NEL and p ro tein exp res s ions of Fas F asL C as p ase 8 and Caspase 3 b y W estern blo t R esults Th e apop to t ic in dex and p rotein ex p ression sof Fas FasL C as p as e 8 and C as p ase 3 were de c re ased si g nifica ntl y in a ll dose Gu anx in He j i g rou p s than those in model g rou p The h igh dose g rou p rece iv ed the best effec t than the o thers Conclusion Guan x in He j i inhibited the m yo card ial apop tosis b y reduc ing apoptosis throu g h Fas FasL p athwa y Key wo rds Guanxin H e j i ap o p tosis AM I acu te myocard ial infarction Fas FasL Caspase 8 Caspase 3 心肌梗死后冠状动脉闭塞血流中断 部分心肌因严重而 心肌梗死预后的主要原因 提高心肌的抗凋亡能力是目前 持久的缺血 导致了心肌细胞的不可逆的损伤 凋亡 是影响 防治心肌梗死的热点之 一 冠心合剂以大剂量的黄芪配伍 失笑散而成 作为治疗冠心病协定方 在我科应用多年 可有 m n 效缓解胸闷 胸痛 气短乏力 心俘心慌 头晕等症 改善心肌 中 收稱日期 2013 06 10 基金项目 浙江省中 医药科技计划项目 誦CB0 54 杭州輔技 血供 既往的研宂提示其对缺血心肌有保护作用 此研 中 局医院重点专科专病项目 20 080333 Q 23 杭州市卫生 究通过观察冠心合剂对大鼠急性心肌梗死后凋亡及缺血边 医 科技计划重点项目 2 008Z008 缘区凋亡蛋白 Fas FasL Caspase 8和Caspase 3蛋白质表 胃 作者简介 陈铁龙 19 77 男 河北沧州人 副 主 任医师 硕士研 达的影响 探讨其对缺血心肌保护的可能机制 245 3 究生导 师 博士 研究方向 心血管疾病介人及中西医结 1 材料与仪器 合治疗 1 1 动物雄性 SD 大鼠 体质量 180 2 2 0 g 由浙江省 g 通讯作者 祝光礼 I95 5 男 浙江杭州人 主任医师 博士研究 实验动物中心提供 生导师 硕士 研究方向 心血管疾病中西 医结合治疗 L 2 药物与试剂 冠心合剂 黄芪30 g 蒲黄2 0 g 五灵 第3 1卷 第 11期 中 华 中 医 药详 1 刊 Vol 3 No 11 2 0 1 3 年 1 1 月 CH INESE ARCHIVES OF T RAD ITIONAL C H INESE MED IC INE Nov 2 0 13 脂 20 g 浓缩成2 g mL的生药煎剂 由杭州市中医院制 剂 剂各剂量组凋亡指数明显低于模型组 差异有显著统计学 室提供 3 3出1 38 鄉 咖 8和0哪挪 3 鼠单克隆 意义 尸 0 05 冠心合剂大剂量组降低凋亡指数的作用 抗体 FasL 兔多克隆抗体 购自美国 San ta Cruze生物技 术 最为明显 见图 1 表1 公司 一抗稀释液 HRP标记二抗 购自杭州达文生物有 限 公司 蛋白质定 量试剂盒 BCA 法 购自北 京普利 莱 基因 技术観公司 T UNEL试激類罗氏公司 2 方法 仏 2 1 动物模型 制作 80 只 SD大鼠随机分为5 组 冠心合 剂大 中 小剂量组 对照组 模型组各 16只 冠心合剂组 于手倾 7 i幵始 灌 胃 剂量分别为2 8 g k g i i4v HHHHH I k g k g d 对照组于相同时间给予灭菌蒸馏水 对照相 模魅a 2 r nL d 灌胃 大鼠麻 醉后 连接实验动物呼吸机行正压呼 吸 用6 o号无创带针缝合线 穿过左冠状动雌降支 进 针深度约为卜2 mm 结扎左冠状动脉前降支 造成 AMI模 J 4 胞数和细胞总数 图像用 Image Pr o Plu s 6 0 软件分析 凋 亡细胞定量计数单位以凋亡指数表示 凋亡指数 凋亡细 v 胞数 总观察细IS数 x 100 S g 球 2 3 W es tern Blo t 法取大鼠左室梗死边缘区心肌组织 标本液氮研碎 加人裂 解 液 经匀浆离心后 取上清 液用 BCA法测定蛋白浓度 变性后 80 C 保存 取各组样品50 Jig 进行 丨2 SDS PAGE并电转移 至PVDF膜上 用 5 大剂影且 胞曰奶粉室温摇賴闭 1 5 h后 加人 抗稀 释液 稀购 图 丨 各组大鼠缺血边缘区心腿 TUNEL染色 20 0 x F as FasL Ca s P a 8 和 Cas p ase 3 抗体 孵育过 夜 力卩人 表 丨 各组大鼠心麵积 调亡指 数结果 s 一抗 H RP标记二抗 1 1000 稀释 E C L 发光液显色 胶 片扫描后用 Im age J软件进行图像分 析 以 p ac tin 1 1 调 1 数 1000稀释 作为内参照对比 比值结果表示其蛋白的相对 8 含量 模 型组 8 58 9 12 1 2 4 统 计学处理采用 SPSS 16 0软件进行统计学处理 计量资料以均数士标准差 i td表示 在正态分布且方差 大 丨 L 8 齐的情况下对其 行单随方 差 分析 画比较采 用哪 仏 组比较w 5 w r 法 0 05 为差异有统计学意义 3 3 冠心合剂对心梗大鼠 Fas及Fa sL蛋白表达的 影 响 3 结 果 i 与对照组比 模型组 Fas Fa sL蛋白表达明显升高 差 异 有 31 職况柳舰大鼠 动贿 反应灵 S綠计学 t义 P cG Gl 冠合剂各纖组Fas F asL 纟 蛋自表細f i随 与翻翻比差异 有显雜计学意义 应迟纯 皮毛 不整 无光泽 饮食M 较少 冠心合纖大鼠 P 0 05 其中冠心合剂大剂量组 Fa s FasL蛋白表达下 活 动度 反 应灵 敏度 皮 毛光 泽和 饮食量 较 模型组 均有 不 同 降幅度最为明显 见图 32 表 2 华 程度改善 大剂量组大鼠接近对照组 大剂亂 中剂狐小舰组 对照组 模戦 1 中 3 2 冠心合剂对心梗大鼠凋亡的影响 经原位末端标记 标记后 讨照组切片中检酬瞧细胞 核染色呈蓝色 模型 fas 4 8kDa 组切片中阳性细胞核染色呈棕褐色 细胞核体积缩小 或明 et in 2454 显皱缩 形态多呈圆形 模型组切片心肌组织中可见大量 K 11 学 阳性细胞核 凋亡指数明显增加 达 58 9 12 I 较X f FasL 40kDa 刊 照组具有统计学差异 p 0 05 冠心合剂组切片中阳性 R WH HNHIMIMHHHH I P a c tin 4 3kDa 细胞核较少 冠心合 剂大中小剂量组凋亡指数分别为 25 2 4 3 32 9 6 5 40 1 8 0 冠心合 图 2冠心合剂对心梗大鼠Fa FasL 蛋白表达的影响 第 31卷 第 11期 中华中医 药学刊 Vo l 3 1 No l l 20 1 3 年 11 月 CH INESE ARCHIVE S OF T RADITIONAL CHINESE MED ICINE Nov 2 0 13 表2 冠心合剂对心梗大鼠Fas及FasL蛋白表达的影响 研究结果显示 正常情况下心肌细胞凋亡非常少 心梗后缺 1 5 Fas p a ctin Kasiy p adin 血心肌的凋亡明显增加 冠心合剂各剂量组的心肌细胞凋 对照组 8 0 19 0 06 0 35 0 08 亡均 不问程度下降 其中冠心合剂大剂量组的调亡指数最 模型组8 0 47 0 1 1 1 03 0 19 低 对心肌细胞凋亡的保护作用最明显 小剂量组 8 0 20 0 03 0 9 1 士0 24 心肌细胞 凋亡由两条途径介导完 成 一条 是内源性途 中剂量组 8 0 18 0 05 0 67 0 15 径 一条是外源性途径 或者同时由两条 一起来完成 内源 欠剂财1 8 310 0 4 51 Q 2 性途径又称为线粒 体途 径 外源性途径可以被FASL 肿 瘤 注 与对照组相比 5 0 05 4 4 3 0 0 1 与模型组相比 坏死因子 a等触发 Fas 又称 CD95 是 一种跨膜蛋 白 P a 05 P 01 属 于肿瘤坏死因子受体超家族成员 是由 325个氨基酸组 3 4 冠心合剂对心梗大鼠Caspase 8 Caspase 3蛋白表 成的受体分子 Fas 一旦和配体FasL 结合 可通过 Fas 分子 达的影 响与对 照组比 心肌 梗死模型组心肌组织巾 启 动致死性信号转导 最终引起细胞 系列特征性变化 使 CaS p a se 8 Cas p ase 3 蛋白表达明显升高 差异有显著统 细胞死亡 本研究结果提示 正常心肌Fas FasL蛋白表 达 计学意 义 0 01 与 肌梗 死模麵比较 冠始M 水平较低 梗后表达上升艱 冠 合剂各纖组不同程 大 中纖组心腿织C as p ase 8 CaspaSe 3表达均明显 麟低了 Fas FasL蛋白的表达 其中冠心合剂大剂量组的 降低 具有统计学意义差异 P 0 05 见图 3 4及表 3 F as F asL 蛋白表达水平最低 Cas p ase 家族 包括 C aspase 1 Cas p as e 14 Cas p ase C as p a sc ISkDa 8参与凋亡执行 并诱导 Caspase 3 激活 启动型 Cas p ase引发Cas p ase 级联反应 然后 活化执行型 Cas p ase 4 3 kDa 裂解特异性底物导致细胞凋亡 6 本研究中观察了冠心 图3各组大鼠心肌组织Ca s p ase 8蛋白的表达结果 合剂降低缺血诱导心梗大鼠Caspase激活 降低 Cas p ase 大剂量组 中剂量组 小 剂鲎组 对照组 模型组 8 Cas p ase 3表达 从而抑制 DNA被Ca s p ase切害 丨 减少调 Cas p ase 3 7UDa 亡的发生 上述结果提示 冠心合剂发挥抗缺血诱导的心 肌细胞调亡可以通过抑制 I 与对照组比较 制是否与其他信号传导途径有关尚待进 一步研究 尸 0 05 P cO O l 参考文献 4 讨论 1 祝光礼 陈铁龙 陈启兰 黄芪失笑汤为主治疗气虚血瘀型冠 急性心肌梗死后 心肌细胞凋亡或坏死 导致心肌部分 心病 J 浙江中西 医结合杂志 200 6 16 10 625 62 6 区域活力心肌细胞减 少或缺失 是心肌梗死临床各种表现 2 祝光礼 周凡 陈铁龙 黄 芪失笑散抗心肌缺血的实验研究 的临床基础 心脏自身再生和修复能力均较弱的器官 对 丨 中华中医药学刊 2007 25 11 2 23 2 2 234 许多 刺激都叫敏感 尤其是缺血 目前认为心肌细胞是不 3 Kajstura J C hen g W R eiss K etal A p optotic necr o tic 可再生的 心肌梗死后心 功能状态与心肌细胞 数量密切相 Ce d6at HS im le p e ndent C m r ibulin g V ariab l6S f in v 一 v 一 farc t size in rat s J 1 Lab Invest 19 96 74 1 86 107 2 1 广H 4 张开 石玉秀