Biolog方法与ECO板碳源.doc

EcoPlateTM各区井中的碳源A1空白Water水一区A2多碳糖-Methyl-D-Glucoside-甲基D-葡萄糖苷A3有机酸D-Galactonic Acid y-LactoneD-半乳糖内酯A4氨基酸L-ArginineL-精氨酸A1Water水二区A2-Methyl-D-Glucoside-甲基D-葡萄糖苷A3D-Galactonc Acid y-LactoneD-半乳糖内酯A4L-ArginineL-精氨酸A1Water水三区A2-Methyl-D-Glucoside-甲基D-葡萄糖苷A3D-Galactonic Acid y-LactoneD-半乳糖内酯A4L-ArginineL-精氨酸B1有机酸Pyruvic Acid Methyl Ester丙酮酸甲脂B2多碳糖D-XyloseD-木糖B3有机酸D-Galacturonic AcidD-半乳糖醛酸B4氨基酸L-AsparagineL-天冬酰胺酸B1Pyruvic Acid Methyl Ester丙酮酸甲脂B2D-XyloseD-木糖B3D-Galacturonic AcidD-半乳糖醛酸B4L-AsparagineL-天冬酰胺酸B1Pyruvic Acid Methyl Ester丙酮酸甲脂B2D-XyloseD-木糖B3D-Galacturonic AcidD-半乳糖醛酸B4L-AsparagineL-天冬酰胺酸C1聚合物Tween 40吐温40C2其他多元醇I-ErythritolI-赤藻糖醇C3有机酸2-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸C4氨基酸L-PhenylalanineL-苯基丙氨酸C1Tween 40吐温40C2I-ErythritolI-赤藻糖醇C32-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸C4L-PhenylalanineL-苯基丙氨酸C1Tween 40吐温40C2I-ErythritolI-赤藻糖醇C32-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸C4L-PhenylalanineL-苯基丙氨酸D1聚合物Tween 80吐温80D2其他多元醇D-MannitolD-甘露醇D3有机酸4-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸D4氨基酸L-SerineL-丝氨酸D1Tween 80吐温80D2D-MannitolD-甘露醇D34-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸D4L-SerineL-丝氨酸D1Tween 80吐温80D2D-MannitolD-甘露醇D34-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸D4L-SerineL-丝氨酸E1聚合物a-Cyclodextrina-环式糊精E2胺N-Acetyl-D-GlucosamineN-乙酰基-D-葡萄胺E3有机酸y-Hydroxybutyric Acidy-羟基丁酸E4氨基酸L-ThreonineL-苏氨酸E1a-Cyclodextrina-环式糊精E2N-Acetyl-D-GlucosamineN-乙酰基-D-葡萄胺E3y-Hydroxybutyric Acidy-羟基丁酸E4L-ThreonineL-苏氨酸E1a-Cyclodextrina-环式糊精E2N-Acetyl-D-GlucosamineN-乙酰基-D-葡萄胺E3y-Hydroxybutyric Acidy-羟基丁酸E4L-ThreonineL-苏氨酸F1多碳糖Glycogen肝糖F2胺酸D-Glucosaminic AcidD-葡萄胺酸F3有机酸Itaconic Acid衣康酸F4氨基酸Glycyl-L-Glutamic Acid甘氨酰-L-谷氨酸F1Glycogen肝糖F2D-Glucosaminic AcidD-葡萄胺酸F3Itaconic Acid衣康酸F4Glycyl-L-Glutamic Acid甘氨酰-L-谷氨酸F1Glycogen肝糖F2D-Glucosaminic AcidD-葡萄胺酸F3Itaconic Acid衣康酸F4Glycyl-L-Glutamic Acid甘氨酰-L-谷氨酸G1多碳糖D-CellobioseD-纤维二糖G2其他Glucose-1-Phosphate葡萄糖-1-磷酸盐G3有机酸a-Ketobutyric Acida-丁酮酸G4胺Phenylethyl-amine苯乙基胺G1D-CellobioseD-纤维二糖G2Glucose-1-Phosphate葡萄糖-1-磷酸盐G3a-Ketobutyric Acida-丁酮酸G4Phenylethyl-amine苯乙基胺G1D-CellobioseD-纤维二糖G2Glucose-1-Phosphate葡萄糖-1-磷酸盐G3a-Ketobutyric Acida-丁酮酸G4Phenylethyl-amine苯乙基胺H1多碳糖a-D-Lactosea-D-乳糖H2多元醇D,L-a-GlycerolD,L-a-甘油H3有机酸D-Malic AcidD-苹果酸H4胺Putrescine腐胺H1a-D-Lactosea-D-乳糖H2D,L-a-GlycerolD,L-a-甘油H3D-Malic AcidD-苹果酸H4Putrescine腐胺H1a-D-Lactosea-D-乳糖H2D,L-a-GlycerolD,L-a-甘油H3D-Malic AcidD-苹果酸H4Putrescine腐胺1.4.3统计试验采用/统计分析系统(6.04版本)中的,()程序分别进行聚类、主成份(因子)分析;并采用系统的程序进行聚类分析.表2.9 计算微生物群落多样性指数的公式多样性指数用途公式备注Shannon多样性指数评估丰富度和均度H=-pi （lnpi）Pi为第i孔的相对吸光值（C-R）与整个平板相对吸光值总和的比率Shannon均匀度通过Shannon指数计算出的均度E= H/lnSS为颜色变化的孔的数目Simpson指数评估某些最常见种的优势度指数ni是第i孔的相对吸光值（C-R）；N是相对吸光值总和；Simpson指数用1/D表示McIntosh指数基于群落物种多维空间上的Euclidian距离的多样性指数同上McIntosh均匀度由McIntosh指数计算得出的均匀度同上2.2.4.6.1 BIOLOG GN微平板 BIOLOG GN微平板是一种多底物的96孔ELISA反应平板。除对照孔A1只装有四氮叠茂和一些营养物质外，其余95孔作为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用产生NADH，引起四氮叠茂发生氧化还原变色反应用于检测(BIOLOG Inc,1993)。微生物对不同碳底物的利用情况可用反应孔中的颜色变化来表示。通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较准确的信息。2.2.4.6.2 操作步骤参照Garland 和 Mills（1991）和杨永华等（2000）的方法，利用BIOLOG GN 微平板来研究不同微生物群落对不同单一碳源利用能力（Sole-Carbon-Sourse Utilization,SCSU）的差异，以获得堆肥微生物群落结构和功能多样性方面的信息。具体步骤如下：a. 加250mL 0.1mol/L磷酸缓冲液（K2HPO4/KH2PO4,pH7.0）于三角瓶中，灭菌;或用250ml 0.85%的NaCl生理盐溶液，灭菌。b. 称相当于25g烘干重的新鲜堆肥，加入三角瓶中，封口（1：10提取液）;c. 摇床振荡1min后，冰浴1min，如此重复3次;d. 静置2min，取上清液3mL于已灭菌的50mL的三角瓶中，加入27mL无菌0.1moL/L磷酸缓冲液，稍加振荡（1：100提取液）;e. 重复步骤d, 直至稀释到每毫升稀释液大约31044104 个微生物;f. 将BIOLOG GN 微平板从冰箱内取出，预热到25;g. 用200 L移液器将稀释液加到微平板孔中，每孔加150 L。将加好样的BIOLOG GN 微平板在28 条件下温育;h. 在温育过程中，每隔一定时间(24、48、72、96、120h)，用318-微平板读数器（318-microplate reader）在590nm处读数来测定各孔吸光值（abs），凡吸光值大于0.25的井，则属于阳性反应。与对照井abs相减得负值的井，在统计分析时其反应定为零。i.在实验过程中，应记录的数据为：吸光值（abs）、吸光值（abs）大于0.25的井数、呈阳性反应井对应的碳源类型。2.3.2 生物多样性数据处理方法堆肥微生物群落BIOLOG GN 微平板在温育过程中的平均每孔颜色变化率（Average well color development, AWCD）的计算方法如下：AWCD值=（C-R）/95，其中C指各反应孔在578nm下测定的吸光值（OD578）， R是对照孔A1的吸光值。采用堆肥微生物在BIOLOG GN 微平板反应72h的数据进行计算。除Shannon多样性指数外，在计算其它多样性指标时，将数据扩大1000倍以防止出现负数。用于计算土壤微生物群落多样性的公式如表2.9（骆世明和彭少麟，1996；杨永华等，2000）。BIOLOG GN 微平板的碳底物组成如表2.10所示，用于将95种碳底物分类。表2.10 BIOLOG GN 微平板的碳底物组成CarbohydratesAdonitol (8) D-Mannitol(22) i-Erythritol(12) Mono-methyL-succinate(35)-D-Glucose(17) D-Mannose(23) L-Arabinose(9) N-acetyL-D-galactosamine(6)-D-Lactose(19) D-Raffinose(27) Cellobiose(11) N-AcetyL-D-glucosamine(7)D-Melibiose(24) L-Rhamnose(28) D-Psicose(26) Methyl pyruvate(34)L-Fucose(14) Sucrose (30) Lactulose(20) m-Inositol(18) D-Sorbitol(29) D-Galactose(15) Turanose(32) Xylitol(33)D-Fructose(13) Gentiobiose(16) Maltose(21) -MethyL-glucoside(25)D-Trehalose(31) D-Arabitol(10) Carboxylic acidsAcetic acid(36) Itaconic acid (49) -Ketobutynicacid(50) -Ketoglutaric acid(51)cis-Aconitic acid(37) Citric acid(38) D,L-Lactic acid(53) D-Galactonic acid lactone(40)D-Glucosaminic acid(43) D-Glucuronic acid(44) D-Saccharic acid(57) -Hydroxy-butyric acid(47)Malonic acid(54) Formic acid(39) Propionic acid(55) -Hydroxybutyric acid(45)-Ketovaleric acid(52) Quinic acid(56) D-Gluconic acid(42) -Hydroxybutyric acid(46)D-Galacturonic acid(41) Sebacic acid(58) Succinic acid(59) p-Hydroxy-phenylacetic acid(48)Amino acidsD,L-Carnitine(82) D-Alanine(64) D-Serine(79) -Aminobutyric acid(83)L-Leucine(74) Hydroxy-L-proline(73) L-Alanine(65) L-Alanyl-glycine(66)L-Aspartic acid(68) L-Glutamic acid(69) L-Histidine(72) GlycyL-L-asparitic acid(70)L-Phenylalanine(76) L-Proline(77) L-Threonine(81) L-Pyroglutamic acid(78)L-Serine(80) L-Asparagine(67) L-Ornithine(75) Glycyl-L-glutamic acid(71)Amines-Amides2-Amino-ethanol(90) Alaninamide(63) Glucuronamide(62)PhenyL-ethylamine(88) Putrescine(89) Succinami