酶工程小抄1.doc

名词解释标志酶：通常可以将只分布于细胞内某个特定组分的酶称为标志酶，可以将它作为细胞组分鉴别的依据，甚至可以判别组织或器官是否发生病变。寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成的酶，分子量一般高于30kDa，具有四级结构。构成寡聚酶的亚基可以相同，也可以不同，亚基之间一般以非共价键排列。多酶复合体：多酶复合体由两个或两个以上的酶靠非共价键连接而成液体深层发酵：也称浸没式培养，它利用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培养方式，发酵过程需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但是原料的利用率和酶的产量都较高，培养条件容易控制。共价催化：又称亲核或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂分别放出电子或吸取电子并作用于底物的缺电子中心或负电子中心，迅速形成不稳定的共价配合物，降低反应的活化能，以达到加速反应的目的。固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。酶反应器：通常将用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。合适的酶反应器可以使酶得到合理的应用，并能提高产品的质量和降低成本。酶分子修饰：通过各种方法可使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。活性酯法：它主要由白蛋白琥珀酰化、活性脂形成和修饰等三个反应组成。亲和标记：对酶的活性部位、受体的结合位点进行特异标记的方法。酶分子定向进化：是从一个或多个已经存在的亲本酶出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具体某些特征的进化酶。易错PCR：是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定的频率随机引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。脱氧核酶：脱氧核酶都是单链DNA分子通过自身卷曲、折叠形成的三维结构，在某些特殊的辅助因子的作用下与底物结合并发挥催化功能。抗体酶：具有催化能力的单克隆抗体，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。拷贝法：是首先将已知酶作为抗原免疫动物，获得抗酶的抗体，再以该抗酶的抗体免疫动物进行单克隆化，以获得单克隆的抗体，用合适的方法对抗体进行筛选，就可得到具有已知酶活性的抗体酶。模拟酶：用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。肽酶：就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。半合成酶：是以天然蛋白或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。分子印迹酶：通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，同时在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列，制备出人工模拟酶。反胶束：当体系中水浓度低于有机溶剂时，形成胶束的表面活性剂的极性端朝向胶束的中部，而非极性端则朝向胶束的外侧，水就被包在了胶束的内部，此时的胶束就叫反胶束。pH记忆：将酶分子从水溶液转移到有机溶剂中，酶能保持原有的离子化状态，此时的环境因素也不能改变酶分子的这种状态，或者说酶在缓冲液中所处的pH状态仍被保持在有机溶剂中的这种现象。必需水：在有机介质中，酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象，一般将维持酶分子完整空间构象所必须的最低水含量称为必需水。水活度：是指在反应体系中水的逸度与纯水逸度之间的比值。糖化酶：即葡萄糖淀粉酶，系统名为-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，大量用作淀粉糖化剂。青霉素酰化酶；又称青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，由一个分子质量为2023kDa、含有侧链结合位点的亚基和一个分子质量为6569kDa、含有催化位点的亚基组成，是半合成抗生素生产过程中有重要作用的一种酶。手性化合物：是指那些化学组成相同，但是立体结构不同而成为恰如人的左右手一样互成对映体的化合物，也称为光学活性化合物。酶传感器：是间接型传感器，它不是直接测定待测物质的浓度，而是利用酶的催化作用，在常温常压下将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通过测定与反应有关的物质浓度，进而推出相应的生物物质浓度。酶标免疫分析：是以待测抗原（或抗体）和酶标抗体（或抗原）的专一结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原(或抗体)含量的一类分析方法，可以分为酶联免疫分析和酶多型免疫分析。靶酶：在生物体内新陈代谢过程中进行的多种化学反应几乎都是在酶的催化下，以一定的速度、按确定的方向进行的。其中的每一种酶都有一些特定的抑制剂，通常将这种酶称为该抑制剂的靶酶。酶标药物：根据药物在生物体内可能的作用目标，如酶或受体，来设计药物，通常将由此获得的药物称为酶标药物。1. 酶生物合成法生产的主要工艺过程包括那几个步骤？(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水2. 如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。参数中，对发酵过程影响较大的有温度、溶解氧浓度等。(1)温度:温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。例如：枯草杆菌的最适温度为34-37，黑曲霉的最适温度为28-32(2)pH:发酵过程中pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5，霉菌和酵母生长的最适pH4-6，放线菌生长的最适pH7-8。(3)溶解氧浓度:对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度 c梯度洗脱法:改变溶液的pH，d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样:体积不能过多，不超过凝胶床体积的5，脱盐时可在10左右。d洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。简述凝胶电泳的分类及其原理？琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。简述酶结晶的主要方法和原理？（1）盐析结晶法：在适当的温度和值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度缓慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程（）有机溶剂结晶法：在接近饱和的酶液中缓慢增加某种有机溶剂，使酶的溶解度缓慢降低，而析出酶晶体的过程（）透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）酶液要浓缩到一定浓度（）等电点结晶法：通缓慢加入浓酶液的值、使之逐渐达到酶的等电点，而析出酶晶体的过程定点突变技术在酶分子修饰中有何应用？定义：指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。应用：新的酶分子结构的设计；突变基因碱基序列的确定；突变基因的获得；新酶的获得。何谓固定化酶？经过固定化以后，酶的特性有哪些改变？固定化酶：固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。改变有：稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在：（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。（2）对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。（3）对变性试剂作用的稳定性： 固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。（4）保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低。(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同 最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移影响固定化酶最适PH的因素主要有两个。 (1) 载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。 (2) 产物性质对最适pH影响；若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。底物特异性：固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。举例说明固定化酶在工业上的应用？现已用于工业化生产的固定化酶主要有：(1) 氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。降低生产成本。 (2) 葡萄糖异构酶：这是世界上生产规模最大的一种固定化酶。常用于连续生产果葡糖浆。 (3) 天门冬氨酸酶：用于工业生产。将延胡索酸转化生产天冬氨酸。（4) 青霉素酰化酶：这是在医药工业上广泛应用的一种固定化酶。用于制造各种生产半合成青霉素和头孢菌素什么是固定化细胞？固定化细胞有何应用？定义：固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞，称为固定化细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，故又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。应用：1、利用固定化微生物细胞生产各种能够分泌到细胞外的产物：(1) 酒精酒类：(2) 氨基酸：(3) 有机酸：(4) 酶和辅酶(5) 抗生素(6）固定化微生物细胞还可以用于甾体转化及有机溶剂、维生素、化工产品等的生产。2、固定化微生物细胞制造微生物传感器：分为呼吸活性测定型和电极活性测定性两种固定化植物细胞的应用。（1）制造人工种子（2）用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。3、固定化动物细胞的应用：主要应用于生产小儿麻痹症疫苗、狂犬病疫苗等酶反应器的设计主要包括哪些内容？1、确定酶反应器的类型。酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照上一节所述的选择原则，选择并确定反应器的类型。2、确定反应器的制造材料。由于酶催化反应具有条件温和的特点，通常都是在常温、常压、pH近乎中性的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。3、进行热量衡算。酶催化反应一般在3070的常温条件下进行，所以热量衡算并不复杂。温度的调节控制也较为简单，通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，进行温度的调节控制，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。对于某些耐高温的酶，例如高温淀粉酶，可以采用喷射式反应器，热量衡算时，根据所使用的水蒸气热焓和用量进行计算。4、进行物料衡算。酶反应动力学参数/底物用量/酶量/反应体积/反应器数量2. 在酶反应器的应用过程中要注意哪些问题？酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。防止微生物污染酶的分类与命名：P酶：主要由蛋白质组成的酶；R酶：主要有核糖核酸组成的酶。酶的分类：根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。酶合成调节的类型诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏酶合成的调节机制：1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。2.末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。3.分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。提高酶产量的措施 ：1.添加诱导物：酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。酶的反应产物：如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。酶的底物类似物：如异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍2.降低阻遏物浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，如在-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。3.添加表面活性剂（产酶促进剂）：改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。酶发酵动力学：主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。产酶动力学：主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。分为宏观酶动力学和微观酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：。式中 X细胞浓度(g /L)； m细胞比生长速率(h-1)；a生长偶联的比产酶系数(IU/g)；t时间(h)；E酶浓度(IU/L)； b非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh)；生长偶联型；部分生长偶联型；非生长偶联型细胞破碎：对于不同的生物体、或同一生物体的不同组织的细胞，由于细胞外层结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，必须根据具体情况进行选择。细胞破碎确认： 1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。 .盐析沉淀法（改变离子强度）：向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：盐溶：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析：原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。盐析的影响因素：离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，2.5%-3%最好。 pH值：等电点处最易沉淀。 温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作。等电点沉淀法：1）.原理：蛋白质在等电点时溶解度最低；不同的蛋白质具有不同的等电点 2）. 使用方法：单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。3）. 优点： 大多数蛋白质的pH都在偏酸性范围内无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 无需除掉多余酸即可进行下一步纯化4）. 缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活 有机溶剂沉淀（降低介电常数）：利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1). 沉淀机理：降低溶液的介电常数；引起蛋白质脱水2). 常用有机溶剂：丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 3).优缺点：优点：分辨率比盐析法高 沉淀不需脱盐溶剂易蒸发，沉淀易离心。缺点:容易引起蛋白质变性失活有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 4）. 影响有机溶剂沉淀的因素温度 ：低温（0）操作。pH值：尽可能靠近其等电点。 离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液 ，增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，目的：防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为520mg/ml 有机聚合物沉淀法： 1）. 作用机理：与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。2）. 沉淀剂：常用聚乙二醇 （简写 PEG ）多用分子量为600020000的 PEG。3）. 优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 1） 热变性：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。2） pH变性：通过改变pH或等电点沉淀法。3） 有机溶剂变性：使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。肽链有限水解修饰1、概念：利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。2、修饰后酶性质的变化:（1）提高酶活力（水解后，主链的断裂有利于酶活性中心的形成，使酶分子显示其催化功能或是酶活力提高）（2）降低或无抗原性（肽链的一部分水解后，仍然可以维持酶活性中心的空间结构，催化功能不变，但其抗原性等特性发生改变，从而提高药用酶的使用价值）3、修饰剂：专一性较强的蛋白酶或肽酶 酶蛋白侧链基团修饰：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰的主要作用：a.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性质和数目b.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定c.探索酶蛋白作用的化学机理d.用于酶蛋白分子的固定化化学修饰方法的几个问题:决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中：对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等 选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性2）修饰剂上反应基团的数目及位置3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间2）酶与修饰剂的比例酶蛋白化学修饰的局限性（缺点）:1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的显示。3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。酶与细胞固定化:借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化。（固定化酶又叫水不溶性酶）天然酶在应用中的一些缺陷（为什么需进行固定化）:1、酶稳定性差，易变性失活2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化。固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。固定化酶的性质: 1. 稳定性2. 最适温度3、最适pH 4、底物特异性稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶 (2) 对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。 （3) 对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。 (4) 保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。 最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同 最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适pH影响(2) 产物性质对最适pH影响载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。 影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固相酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固相酶，其最适pH比游离酶高。反之，亦然。（见示意图）产物性质对最适pH影响:若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。影响的原因：由于微环境扩散限制影响，嵌在载体中的酶，当其催化反应产生酸性产物时，产物的扩散活动受到微环境的约束和限制，使产物不易扩散出去，以致在微环境中，出现局部pH浓度梯度，越靠近微环境表面的地方pH越低。这时，外部环境的pH就要提高一点，才能抵消微环境的这种作用，使酶达到最适pH。底物特异性：固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。影响原因：固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。固定化酶的应用:固定化酶在医疗上的应用：（1）作为治疗药物：固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。作为治疗药物，溶液酶具有一些“致命”弱点： 酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应 酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白酶水解破坏。 由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。（2）作为“人工脏器”： 固定化酶可做成“人工脏器”参与体外循环，其应用主要有两方面：a.用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢尾产物 b. 除去(一种或多种)氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”固定化酶在工业生产中的应用：现已用于工业化生产的固定化酶主要有： (1) 氨基酰化酶 (2) 葡萄糖异构酶(3) 天门冬氨酸酶： (4) 青霉素酰化酶酶非水相催化的应用:手性药物的拆分；手性高分子聚合物的制备；酚树脂的合成；导电有机聚合物的合成；发光有机聚合物的合成；食品添加剂的生产；生物柴油的生产。手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物生物柴油:生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽油，废食用油等优点：（1） 具有良好的环境属性（2） 具有较好的低温发动机启动性能。（3） 具有较好的润滑性能。（4） 具有较好的安全性能。（5） 具有良好的燃料性能。（6） 具有可再生性能。影响酶反应器选择的因素：酶的形式(游离/固定化.)；固定化酶的形状；底物的物理性质；酶反应动力学性质；酶的稳定性；操作要求；反应器制造、控制成本。酶反应器使用中应注意的问题：酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。防止微生物污染：酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶从载体上脱落；（3）载体的破碎或溶解。酶工程主要涉及哪些方面的研究和运用。酶工程主要指天然酶制剂在工业上的大规模应用，由4个部分组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化； 生物反应器。酶工程的应用范围:（1）对生物宝库中存在天然酶的开发 和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与 其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定 化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。应用微生物来开发酶有哪些优点。微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶微生物培养基来源广泛、价格便宜可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种什么是专一性不可逆抑制，试举例说明。专一性不可逆抑制：不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。如有机磷杀虫剂抑制昆虫的乙酰胆碱酯酶就是这种方式。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。以枯草芽胞杆菌的分离为例：带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80烘箱处理30min。配制分离选择培养基，灭菌备用。稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混 合均匀后再取1ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml 到第三支试管中，以此类推。配制斜面培养基，灭菌备用。涂布培养：取 10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8 个平板，倒置后在 37培养24-48 小时， 观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在 37培养。酶发酵生产的菌株一般需具备什么条件。不是致病菌，在系统发育上最好是与病原体无关能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高菌种不易变异退化，不易感染噬菌体最好选用产生胞外菌的菌种，有利于酶的分离，回收率高产酶微生物诱变育种步骤的主要方法和步骤主要方法：物理、化学或生物诱变方法 诱变育种步骤：出发菌株的选择、处理菌悬液的制备、诱变处理、中间培养、分离和筛选简要说明微生物产酶（生产）的主要发酵方式（1）固体发酵法：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用。 分为浅盘法、转桶法、厚层通气法等（2）液体发酵：以液体为培养基，进行微生物的生产繁殖和产酶。分为液体表层发酵法和液体深层发酵法（3）固定化细胞发酵优点：固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；发酵稳定性好，可以连续使用较长时间，易于连续化，自动化生产；可在高稀释率的条件下连续发酵（Dm）,提高设备利用率；发酵液含菌体较少，利于产品分离。哪些因素影响微生物发酵产酶？如何提高微生物产酶量?培养基营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂、微量元素以及发酵条件：pH值、温度、溶解氧、泡沫、湿度均影响微生物发酵产酶。提高微生物产酶量的方法主要有：通过条件控制提高产酶量，如添加诱导物、降低阻遏物浓度；通过基因突变提高产酶量，如使诱导型转变为组成型、使阻遏型转变为去阻遏型；其他方法，如添加表面活性剂、使用其他产酶促进剂什么是组成型突变，什么是抗分解代谢物阻遏突变？组成型突变：与酶的合成有关的调节基因的一种突变。即原来酶的合成量受调节基因调节的诱导酶或阻遏酶，由于调节基因发生变异，酶的合成变为组成型（不管生长条件如何，酶的合成量总是恒定的）的一种现象。分解代谢物效应（阻遏）指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。抗分解代谢物阻遏突变是指产生的突变解除了分解代谢物阻遏。酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA相对稳定。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。其对应的mRNA稳定性高。其中最理想的合成模式是延续合成型。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成 一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。什么是固定化酶，它们用于生产有哪些优点固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。优点：极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；可以再较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化；酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化；在绝大多数情况下提高了酶的稳定性；较能适应于多酶反应；酶的使用效率提高，产物得率提高，产品品质有保障，成本低酶的固定化方法主要有哪些？作简单阐述将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价键结合法，以及交联法等1.包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。操作简单，可制得较高活力的固定化酶。2.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等.操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不太牢固易脱落3.共价键结合法：酶蛋白侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。4.交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制得固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。制备的固定化酶结合牢固，可长时使用.但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大结合实验阐述一种固定化菌体的方法和步骤。以酵母细胞的固定化为例，本实验固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。通过包埋法，对酵母活细胞进行固定。并对麦芽汁进行发酵实验。操作步骤调取活化培养24h的酵母斜面菌种一环，接种于10ml麦芽汁试管中，25摇瓶培养48h。取酵母菌体悬浮 液 10mL，悬浮在10mL4%海藻酸钠溶液（冷却到约50度不太烫手）中混合均匀。用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50