小鼠胚胎干细胞饲养层的制备.doc

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备作者：胡一新,黄王景单位：1.贵州省贵阳市第二人民医院，贵州 贵阳 550003 2.贵阳医学院附属医院儿科，贵州 贵阳 550003【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中，含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞，观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行，胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长，且保持未分化状态。 【关键词】 胚胎成纤维细胞;小鼠;胚胎干细胞 Preparation of feeder cells of mouse embryonic stem cell HU Yi-xin1, HUANG Jing2（1.The Second People′s Hospital of Guiyang City, Guiyang 550003, China；2.The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550003,China） Abstract：ObjectiveTo investigate the preparation methods of feeder cells of mouse embryonic stem cell.MethodMouse embryonic stem cell were observed in two culture systems：on feeder cells of the primary mouse embryo fibroblasts and in leukemia inhibititory factor on free-feeder cells.ResultsThe primary mouse embryo fibroblasts were observed radially or circinately.The ES cells clone appeared typically.ConclusionThe ES cells can grow well and maintain in the state of undifferentiation under the conditions. Key Words:Embryo fibroblasts；Mouse；Embryonic stem cell 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell）是具有自我更新和多向分化能力的一类增殖旺盛的细胞，具有向机体各种组织细胞分化的潜能。体外培养中，为保持ES细胞的不分化，往往需将其接种于一定的饲养层上或加入白血病抑制因子。目前常用的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）、STO细胞等。由于STO细胞价格昂贵，不易获得，故本试验选择MEF为饲养层细胞，探讨胚胎干细胞饲养层的制备方法，为胚胎干细胞的体外培养打下基础。 1 资料与方法 1.1 主要试剂及仪器：低糖DMEM培养基、非必须氨基酸(购自Gibco公司)；小牛血清(购自杭州四季青公司)；0.25%胰酶、胎牛血清(购自Hyclone公司)；重组小鼠白血病抑制因子（rmLIF）(Chemicon公司产品)。 1.2 细胞株：小鼠胚胎干细胞E14细胞株由中山大学干细胞中心提供。 1.3 主要溶液的配制：小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts ，MEF）培养液：低糖DMEM+10%小牛血清。ES细胞培养液：高糖DMEM+ 15%胎牛血清，在无饲养层时另加入rmLIF10ng/ml。丝裂霉素：浓度为10μg/ml，以培养液新鲜配制。 1.4 方法 1.4.1 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养：取1214d的妊娠小鼠，颈椎法处死后，用75酒精浸泡5min。无菌条件下剖腹，暴露子宫，取出胎鼠，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤以去除血迹。去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，PBS液洗净，用灭菌的眼科小剪刀把组织块剪至1mm3大小,向组织块加入适量的胰蛋白酶EDTA消化液，37下消化2min。加等体积含血清的培养基终止消化，静置，将组织块沉降后，将培养基吸至无菌试管中。无菌试管离心（1 000r/min）5min，弃上清，沉渣用含10%小牛血清的低糖DMEM培养液悬浮后接种至25cm2一次性培养瓶，置于37、5CO2、100%湿度的培养箱中培养。培养开始2d不要晃动培养瓶，第3天换液，并去掉组织块和死细胞。每12d换液1次，如细胞已铺满，按1213传代，传35代的细胞可做为饲养层使用。 1.4.2 饲养层的制备：取1瓶快长满的胚胎成纤维细胞，吸掉原培养基，用PBS洗3次，加入含10μg/ml丝裂霉素C和10小牛血清的低糖DMEM培养基，将培养瓶放回培养箱1.52h。弃去含丝裂霉素C的培养基，用PBS洗5次以去除残余的丝裂霉素，加胰蛋白酶EDTA消化，转到用0.1明胶处理过的培养瓶中（0.1%明胶覆盖培养瓶表面，室温放置2h以上，用前吸弃多余明胶，干燥后使用）。37、5CO2、100%湿度的培养箱中培养，细胞很快贴壁并铺层为单层，细胞若过稀，补加丝裂霉素处理过的细胞，1周内用于ES培养。用前更换为ES细胞培养液。 1.4.3 E14的培养：E14种植到用丝裂霉素处理过的饲养单层上,换成ES细胞培养液。同时另将E14种植于无饲养层细胞、但培养液中含LIF的培养皿中。每天观察，及时更换培养液，每23d以1316的比例传代。 2 结果 2.1 MEF的细胞形态观察：（图1）MEF接种后，游离期一般为 34h 。56h后绝大部分细胞贴壁，12h之后即可进入增殖期，细胞增殖较快，当达到一定的密度（60%70%汇合）时，生长更为迅速。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。生长旺盛的细胞之间的连接非常紧密，48h后即可形成细胞单层。倒置显微镜下观察，细胞稀疏时，细胞透明，颗粒很少，大多数细胞的胞质形成23个突起，呈长梭形，胞质轮廓不清，一般胞体的中心部，即核存在的位置稍稍隆起，立体感强。细胞连成单层时细胞间界限不清。胚胎成纤维细胞在体外一般3周后细胞逐渐衰老，表现为胞质内颗粒物质增多，透明度变差，细胞轮廓增强，逐渐收缩，附壁不牢，最终可从皿底脱落，收缩成一团。 图1 小鼠胚胎成纤维细胞（×200） 2.2 饲养层：用丝裂霉素C处理MEF制作的饲养层细胞，其一般性状均无明显变化，只是不再发生增殖。饲养层细胞制备后，24h之后可投入使用。1周内使用，1周后细胞死亡，逐渐从培养瓶底脱落。 2.3 E14的形态观察：E14细胞接种在小鼠胚胎原代成纤维细胞制作的饲细胞层上之后，呈一典型的克隆状生长, 呈长梭形或椭圆形, 结构均匀,表面光滑，细胞小，克隆内细胞紧密地聚集在一起，克隆周边与饲细胞层界限清楚，无分化迹象。E14脱饲养层加入LIF后，仍能维持良好的克隆状生长，保持未分化状态，与在饲养层上生长相比，细胞克隆较小，呈岛屿状生长，边界清楚。 3 讨论 MEF作为饲养层培养ES细胞是一种最早和常用的方法1-3。MEF主要作用是分泌LIF等能产生抑制ES细胞自主分化的因子和促进ES细胞增殖的因子,故它能有效地促进ES细胞的增殖并维持其未分化性和多潜能性。MEF在第35代时使用最好，对已进入对数生长期的细胞，应及时制作饲养层或传代、冻存，把握传代的最佳时机，即大约80汇合时就应传代，避免因密度过大产生接触抑制而使细胞过早老化。每次尽可能多做、多冻存一些MEF备用,以保持MEF使用的一致性。 饲养细胞层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作克隆细胞附着底物且能产生多种营养因子的细胞层。目前，分离培养ES细胞有采用MEF作为饲养层，也有采用STO细胞或SNL细胞(STO细胞转染了neor和LIF基因)作为饲养层的。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后,虽然失去分裂能力,但仍然保持生存能力，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，而且可以除去体外培养环境中的毒素和代谢抑制因子4。本试验选用MEF作为饲养层细胞，来源丰富、经济、抑制干细胞分化能力强，大多数试验采用。MEF如果用丝裂霉素C处理,须彻底清洗,否则残余的丝裂霉素C会影响ES细胞的增殖。 LIF是一种能抑制ES细胞自发性分化的分泌性多肽细胞因子，纯化的LIF完全能代替小鼠胚胎成纤维细胞抑制ES细胞的分化5，但LIF很昂贵，且无MEF那样分泌促进细胞增殖的因子，故在ES的传代建系中仍使用MEF作饲养细胞。【参考文献】1 Cella M, Sallusto F, Lanzavecchia A.Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cellsJ.Curr Opin Immunol, 1997,9 (1)：10.2 Tatsuya K, Pawal K, Oriana C, et al.Cermide mediates tumor induced dendritic cells apoptosisJ.Immunol，2001，167(6)：3773.3 Shurin MR, Kirkwood J, Esche MC,et al.Cytokine-based therapy for melanoma：preclinical studiesJ.Forum Trends Exp Clin Med,2000,10（2)：205.4 Bubenik J.Genetically engineered dendritic cells based cancer vaccines (review)J.Int J Oncol, 2001, 18(3)：475.5 Choudhury A, Janes L, Gajewski JC, et al.Use of leukem