地道南药——岗梅(Ilex asprella )的无性繁殖试验

序号： 编码： 第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称：地道南药岗梅(Ilex asprella )的无性繁殖试验 学校全称： 华 南 农 业 大 学 申报者姓名 （集体名称）： 黄泽鹏 柯伟洪 陈春苑 房晔 骆永雅 刘嘉 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名黄泽鹏性别男出生年月1985年3月学校华南农业大学系别、专业、年级林学院04园林4班学历本科学制四年入学时间2004年9月作品名称地道南药岗梅(Ilex asprella )的无性繁殖试验毕业论文题目通讯地址华南农业大学林学院04园林4班邮政编码510642办公电住地通讯地址广州天河区华南农业大学五山学生公寓10栋212房邮政编码510642住宅电话38635848其他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位柯伟洪男22本科华南农业大学 林学院04园林4班陈春苑女22本科华南农业大学 林学院04林学2班房晔女24本科华南农业大学 林学院04林学2班骆咏雅女20本科华南农业大学 林学院05森林资产管理1班刘嘉男22本科华南农业大学 林学院04林学3班资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2006年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是 否 （部门签章）年 月 日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是 否负责人签名：年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（ D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路岗梅(Ilex asprella )是广东省著名的地道南药，具有清热解毒，生津活血等功能，广泛应用于感冒发热，扁桃体炎，咽喉炎，气管炎，百日咳，肠炎，痢疾，跌打损伤等，在多种药品（如广东凉茶、六和茶等）中大量使用。据资料统计，目前国内岗梅每年的干物质消耗量达6000吨，而岗梅的主要药用部位是根部，因此对野生植物资源的破坏性很大，野生岗梅正由于被大量挖掘而面临资源匮乏，因此开展岗梅人工种植是解决岗梅供需矛盾、保护野生资源的唯一途径。开展人工化种植需要解决的首要任务是种苗问题，而冬青科植物的种子普遍具有休眠的特性，根据我们已开展的播种实验也证明了岗梅种子的休眠特性，因此采用播种繁殖比较困难，而且种苗数量也受到一定限制；采用无性繁殖技术不仅可以快速地获取大量的苗木，解决生产的需要，同时具有保持优良性状的特点。本试验从无性繁殖入手，以解决岗梅大量的种苗需求和药材资源来源。岗梅从野生到家种是一项重大的科研课题，其意义不仅仅是解决药材资源来源，而且为野生药材资源的合理开发利用以及保护提供示范性作用；同时为山区农民种植药材提高经济水平提供技术支持。本研究的主要结果为：（1）探讨出一套岗梅无性繁殖的技术流程。（2）筛选出适合岗梅无菌芽快速繁殖的组织培养配方，以及筛选出最佳的扦插繁殖方案。本实验以扦插和植物组织培养两种方式进行。插穗与组织培养材料以华南农业大学树木园内天然生长的岗梅为母株，并经广州王老吉药业研究所黄荣林高级工程师鉴定为正品。一、扦插繁殖实验：从母株上截取萌发较好的不同茎粗（按粗细大小0mmd2mm、2mmd4mm、4mmd6mm和 6mm6mm时，以上6个指标值都呈下降趋势。从试验中得出，径粗为4mmd6mm的插穗比较适宜在冬季扦插。（2）通过比较径粗为0mmd2mm、2mmd4mm、4mmd6mm和6mmd10mm的插穗在河沙和园土两种基质中的生长发育情况可得，河沙明显有利于插穗的生根和新梢的萌发，其中各项生长指标和生理指标都高于园土中的。由此可见，选用河沙做扦插基质是比较合理的。（3）应用不同浓度的NAA(100/、200/、300/、400/)来处理径粗为4mmd6mm的插穗，用清水浸泡作对照，并研究其在河沙中的生根效果及生长情况。结果表明,与对照相比,插穗用浓度为100/的NAA浸泡3.5个小时后可极显著提高它的生根率、根数和根长。综合考虑基质、径粗和NAA浓度这三个扦插穗件对梅叶冬青嫩枝插穗生长发育的影响，本人认为在冬季用浓度为100/的NAA处理径粗为4mmd6mm的插穗后再在河沙中进行扦插繁殖是比较成功的。组织培养试验：采用岗梅的带芽茎段作为外植体材料，用0.1%升汞进行不同时间的灭菌处理，同时对取材季节进行了研究，所得的岗梅无菌芽接种到含有不同激素配比的培养基中，研究无菌芽的生长状况。结果表明：（1）在低温干燥的秋冬季节取材，岗梅带芽茎段污染率最低可达0、发芽率最高可达100。（2）0.1升汞不同时灭菌处理效果都很好，污染率都低于7，发芽率高于89，褐化率低于8。建议对材料灭菌3min，因为这种处理既不会使半木质化的材料褐化，也节省灭菌操作的时间，同时还观察到在此时间下外植体材料的活性高于其他时间处理，具体表现为叶柄脱落的时间提早了。（3）综合各种因素，提出岗梅带芽茎段外植体使用的灭菌流程：将材料用洗洁精洗干净，用95的酒精洗15s，用自来水冲洗干净后在超净工作台上用新洁尔灭（苯扎溴铵）稀释50倍溶液灭菌20min，无菌水冲洗46次，用0.1升汞灭菌3min，用无菌水冲洗5次，把完成灭菌程序的材料接入培养基进行培养。（4）附加了不同浓度6-BA的培养基，均可对岗梅无菌芽诱导出不定芽，随着6BA浓度的增大，不定芽的倍增率增大，6BA浓度为4.0mg/L时，不定芽的倍增率最大，平均为3.87。 6BA浓度为1.0mg/L时，无菌芽的株高生长最大，平均为4.77mm，该浓度下，单个无菌芽的最大株高生长为14mm。（5）不同浓度的NAA对岗梅无菌芽诱导生根的影响不明显，没有诱导出不定根，也没有愈伤组织，随着NAA浓度的增大，褐化现象加重。没有观察到明显的芽分化和植株伸长。（6）在6BA与NAA配合使用的条件下，6BA为2.0mg/L、NAA为0.01mg/L时，岗梅无菌芽的不定芽倍增率最高，平均为4.75。当6BA为2.0mg/L、NAA为0.05mg/L时，无菌芽的株高生长最大，平均为6.03mm，该配方下，单个无菌芽的最大株高生长为22mm。关键词：岗梅 繁殖 扦插 植物组织培养 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录参考文献：1 吴永彬等,岗梅扦插繁殖试验,中药材2006,29（5）:4294302 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴第二册.北京.科学出版社.1972.6423 浙江中医药大学/wljx/Medicine/kejian2/PART79/02 .HTM4 广东生怀集福盛药业有限公司 /fs/ProductShow.asp?ArticleID=1025 罗集鹏，毕培曦.岗梅的形态组织学与高效液相色普法鉴别.药物分析杂志.1995，15（3）：36 余鸿生/2005/New/Article-Print.asp?ArticleID=6837 Kashiwada Y Zhang DC,Chen YP. Antitumor anents, 145. Cytotoxic asprellic acids A and C and asprellic acid B. new p-coumaroyl triterpenens,from Ilex asprella. Journal Of Natural Products. 1993,56(2): 2077-828 李敏华，俞世杰，杜上槛.岗梅根化学成分的研究. 中草药. 1997,28(8):454-4569 廖月葵，周丽霞，朱华. 白点称的显微与紫外吸收光谱鉴别.中药材. 2002，25（8）：51155210 钟智，杨晓军，吴雪梅. 复方岗梅冲剂提取工艺的试验研究. 中国现代应用药学杂志. 2004，21（1）：293011 刘郴淑，陈华萍，李卫群. 岗梅根乙醇提取物的抗炎作用. 中药材. 2004，27（7）：519520申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）申报论文一篇科研管理部门签章 年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。目前对岗梅研究多集中在它的药用价值方面。如Kashiwada等人从岗梅中分离出新的抗肿瘤药物对香豆酰三萜类1；李敏华等对岗梅根的化学成分进行研究，得到的5个化合物都是首次从该植物中分离出来的2；为更好开发利用这一资源并提供地方中草药标准，廖月葵等进行了岗梅的显微镜及紫外光谱鉴别研究3；钟智等为了寻找复方岗梅冲剂最佳提取工艺，进行了复方岗梅冲剂提取的试验研究4；刘郴淑等从抗炎的角度探讨了岗梅根乙醇提取物的药理活性5。但目前针对岗梅进行快速繁殖的研究还未有报道，迄今仅见到国内外学者做了有关苦丁茶等植物的扦插繁殖报道，但未对岗梅的无性繁殖做过任何的研究。参考文献：1Kashiwada Y Zhang DC,Chen YP. Antitumor anents, 145. Cytotoxic asprellic acids A and C and asprellic acid B. new p-coumaroyl triterpenens,from Ilex asprella. Journal Of Natural Products. 1993,56(2): 2077-822李敏华，俞世杰，杜上槛.岗梅根化学成分的研究. 中草药. 1997,28(8):454-4563廖月葵，周丽霞，朱华. 白点称的显微与紫外吸收光谱鉴别.中药材. 2002，25（8）：5115524钟智，杨晓军，吴雪梅. 复方岗梅冲剂提取工艺的试验研究. 中国现代应用药学杂志. 2004，21（1）：29305刘郴淑，陈华萍，李卫群. 岗梅根乙醇提取物的抗炎作用. 中药材. 2004，27（7）：519520D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名李秉滔性别男年龄69职称教授，博导工作单位华南农业大学林学院通讯地址广州天河华南农业大学林学院邮政编码510642单位电话02085280258住宅电话02085280485推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述申报情况属实，同意推荐 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价药材人工化标准化种植是保证药材质量的重要途径，也是保护野生资源，走可持续发展道路的根本保证。岗梅根是广东的著名药材，用途十分广泛，由于近年来消耗量很大，已经逐渐出现药源短缺现象，开展岗梅人工种植是解决供需矛盾、保护生态环境的有效途径。黄泽鹏等同学能在导师的指导下开展无性繁殖研究，解决人工种植的种苗问题，对推广这一著名南药的规模化种植具有十分重要的现实意义。 推荐人： 2007年3月10日 其它说明推荐者情况姓 名庄雪影性别女年龄45职称教授，博导工作单位华南农业大学林学院通讯地址广州天河华南农业大学林学院邮编510642单位电话85280258住宅电话02085281703推荐者所在单位签章 签章日期 年 月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述申报情况属实，同意推荐 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价岗梅是华南地区常见的药用植物，是广东凉茶、六合茶等的主要药用成分，用量很大，而且岗梅的药用部位是根部，开展岗梅人工化种植是解决供需矛盾、保护生态环境的有效途径。该研究小组在导师的指导下开展无性繁殖研究。解决人工种植中的种苗问题，对推广岗梅的规模化种植具有十分重要的现实意义。该研究选题难度适中，可操作性较强，同意推荐。 推荐人： 2007年3月10日其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处地道南药岗梅(Ilex asprella )的无性繁殖试验黄泽鹏 柯伟洪 陈春苑 房晔 骆咏雅 刘嘉指导老师：吴永彬 刘天颐(华南农业大学林学院，广州，510642 )摘 要：为了探讨岗梅的快速繁殖方法，研究出一套切实可行的快速繁殖方案，对其分别进行了扦插和组织培养试验。在扦插试验中，用不同基质、不同粗细和不同激素浓度对岗梅进行扦插繁殖试验，结果表明：在冬季用浓度为100mg/L的NAA（萘乙酸）处理粗细为4mm5mm)的插穗，在河沙中插穗的新梢萌发率比园土高，在近似同等的萌条数情况下，河沙中插穗的新梢长是园土的4倍。在园土中，径粗为3mmd5mm的插穗新梢萌发率和新梢萌条数小于径粗为5mmd7mm的插穗，但新梢长度明显增大，该反常现象可能与土壤的营养量有关。方差分析结果说明了基质和径粗对新梢长度的交互影响是极为显著的。由此可见，在一定范围内，插穗的径粗越大，本身的组织结构越完善成熟，越有利于新梢的生长发育，而且插穗生根发芽后，土壤的营养含量要适当补充予以满足地上部分的生长。 表2 不同基质和不同径粗对插穗地上部分新梢生长的影响Tab.2 Comparison of shoots growth of cuttings with different sorts and diameter classes基质sort1mmd3mm3mmd5mm5mmd7mm萌条数number of shoot长度/cm length of root/cm萌发率/% shoot growing rate/%萌条数number of shoot长度/cm length of root/cm萌发率/% shoot growing rate/%萌条数number of shoot长度/cm length of root/cm萌发率/% shoot growing rate/%河沙sand0.750.041.170.0553.831.330.032.680.3462.231.8584.47园土soil1.010.220.590.0255.571.280.271.630.2370.031.440.111.090.2177.772.2.3 不同NAA浓度对插穗生根率、根数和根长生长的影响在母株上选取径粗为5 mmd7 mm的一年生枝条做插穗，用100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L四个浓度的NAA作为生长调节剂来试验，并用清水作对照（CK），结果如表3，当NAA浓度小于200 mg/L时，NAA的处理促进根长的增长，100 mg/L和200 mg/L处理组的平均根长分别为1.91 cm和1.14 cm，而对照组的平均根长为0.94 cm；当NAA浓度大于200 mg/L时，浓度的处理抑制根长的增长；当NAA浓度为400 mg/L时,插穗的平均根长只有对照组的1/6。可见，NAA具有促进和抑制插穗生长的二重性,适宜浓度(100200 mg/L)的NAA处理明显提高了插穗的成活率。表3 不同浓度NAA处理对插穗生根数和根长的影响Tab.3 Comparison of roots growth of cuttings with different concentration of NAA处理组 treatmentsCK100 mg/L200 mg/L300 mg/L400 mg/L根数 number of root2.630.7026.692.5925.836.2612.51.993.581.25根长/cm length of root/cm0.940.301.940.470.060.150.04注: P0.01，P0.05从图1显示，当NAA浓度小于100 mg/L时，浓度越高，根系生长越好；当NAA浓度在100 mg/L200 mg/L之间时，浓度越高，根系生长则越差；而高浓度（300 mg/L以上）的NAA处理则严重抑制插穗的生长，插穗失去活性而死亡。图1 不同激素处理对插穗生根数和根长的影响Fig.1 Comparison of roots growth of cuttings with different concentration of NAA2.3结论综上，本试验从选用的基质看，通过插穗的各生长指标的测定发现，在河沙中扦插的插穗，其各指标均高于园土，其中生根率达到61.10%，为园土的2倍，可见河沙对根系的生长发育比较有利。比较插穗在不同径粗的范围内的生长情况可得，径粗为5mmd7mm的插穗最具有生长优势，其生根率比径粗为1mmd2mm的插穗增长了3倍，比径粗为2d4的插穗增长了2倍，而且新梢萌发率达到84.47%。综合考虑基质、径粗和NAA三种因素对岗梅的扦插繁殖的影响可知，在进行岗梅的扦插繁殖时，用径粗为4mmd6mmN浓度为100mg/L的NAA在河沙中扦插效果最好。图版1 图版说明：1. 清水处理组（CK） 2. 100mg/L的NAA处理组3. 200mg/L的NAA处理组 4. 300mg/L的NAA处理组5. 400mg/L的NAA处理组 6. 400mg/L的NAA处理组Explanation of plate 1: Fig.1 without treatment (CK) Fig.2 the treatment of NAA100mg/LFig.3 the treatment of NAA200mg/L Fig.4 the treatment of NAA300mg/L Fig.5,6 the treatment of NAA400mg/L3 岗梅组织培养试验本试验以岗梅的地上茎作为材料，探讨不同灭菌方法的灭菌效果，及其对材料发芽的影响，同时研究了6-BA和NAA对岗梅无菌芽生长的影响。本文就0.1%升汞不同灭菌时间对岗梅地上茎外植体的灭菌效果作了研究，总结了这种灭菌剂的最佳灭菌方案；然后把得到的无菌不定芽作为材料接入含有激素的培养基中，探讨单独使用6-BA和NAA以及二者不同浓度配比对材料组织培养效果的影响。本研究尝试通过组织培养进行岗梅的快速繁殖，满足市场上对岗梅的需求。3.1 材料与方法试验材料取自华南农业大学树木标本园，并经广州王老吉药业研究所黄荣林高级工程师鉴定为正品。3.1.1 建立无菌植株 在不同季节选取长度约23cm无病、健壮、木质化的带有1个腋芽的岗梅茎段，用洗洁精洗干净，用95的酒精漂洗15s，用自来水冲洗干净后在超净工作台上用苯扎溴铵（新洁尔灭）稀释50倍溶液灭菌20min，无菌水冲洗46次，材料继续用0.1%升汞进行灭菌，最后用无菌水冲洗5次。把完成灭菌程序的茎段两端和叶柄剪去，留下11.5cm的茎段（本试验每流程处理的20个人以上外植体材料），然后接种在MS培养基（加琼脂粉6g/L，蔗糖30g/L,pH=5.65.8，在121126下高温灭菌20min）进行培养。每天光照12h，光照强度为2000Lx，温度控制在251。3.1.2无菌芽的诱导 单激素诱导岗梅无菌芽的方法 把无菌芽切去基部褐化部分，接种于只含6-BA或NAA的培养基中。其中编号为01、02、03、04的4个配方，每个配方接入25个无菌芽；其他配方，每个配方接入40个无菌芽。置于培养室培养，观察无菌芽的生长状态。（表4）表46-BA、NAA培养基生长调节剂含量（单位：mg/L）Tab.4 Concentration of 6-BA、NAA 编号Number6-BANAA编号Number6-BANAA010.500800.1021.000900.5032.0001001.0043.0001102.0054.0001203.00600.0101304.00700.0501405.0 细胞分裂素、生长素配合使用诱导岗梅无菌芽的方法 把无菌芽切去基部褐化部分，接种于含有6-BA和NAA的培养基中，每个配方接入40个无菌芽。置于培养室培养，观察无菌芽的生长状态。（表5）表56-BANAA培养基生长调节剂含量（单位：mg/L）Tab.5 Concentration of 6-BA+NAA编号Number6-BANAA编号Number6-BANAA10.50.0161.0572.00.00.0541.00.0192.00.151.00.053.2结果与分析3.2.1 不同取材季节灭菌效果的比较试验结果（见表6）表明，灭菌效果与季节条件有密切的关系。夏季，温度和湿度都较高，有利于微生物的生长繁殖。秋冬季，温度和湿度逐渐降低，材料所带的细菌和真菌减少，所以灭菌效果较好。表6不同取材季节0.1%升汞处理材料的效果Tab.6 Comparison of the explant from different season using the germicide 0.1%Hgcl2灭菌时间（min）sterilizing time污染率（%）contamination rate夏季 秋冬季summer autumn and winter发芽率（%）germination rate夏季 秋冬季summer autumn and winter1537309338431492576620893.3.2 0.1%升汞不同处理时间对外植体材料的影响在秋冬季，用0.1%升汞对材料进行不同时间的处理。试验结果表明，灭菌效果都很好，污染率低于7%，发芽率高于92%。不同灭菌时间的效果差异不大，而且没有明显的趋势。从表4中可知，对材料处理0.5min和7min时，发芽率为100%。在试验观察中我们还发现，茎段接种3d后叶柄开始脱落，而且处理的时间越长，叶柄脱落的时间就越早，但是随着处理时间加长，也出现了轻微的褐化现象。表7 0.1%升汞处理材料的效果(秋冬季)Tab.7 Result of using the germicide 0.1%HgCl2 (autumn and winter)灭菌时间（min）sterilizing time污染率（%）contamination rate发芽率（%）germination rate褐化率（%）browning rate0.5010001793033925479305689560928701000849601009283.3.3 6-BA对岗梅不定芽诱导的影响把岗梅无菌芽接种在不同6-BA浓度的培养基上培养28d，观察其芽的生长情况（如表8）。在本试验中，6BA浓度为4.0mg/L时，不定芽的倍增率最大，平均为3.87。当6-BA浓度为1.0mg/L时，岗梅无菌芽的株高生长最大，平均为4.77mm，该浓度下，单个无菌芽的最大株高生长为14mm。表8 6-BA对岗梅无菌芽生长状态的影响Tab.8 Comparison of the concentration of 6-BA to the adventitious budsgrowth 编号number不定芽倍增率increasing rate of adventitious buds株高平均生长量（mm）average height of the stalk012.161.72022.684.77032.803.64042.732.64053.871.593.3.4 NAA对岗梅无菌芽生长状态的影响把岗梅无菌芽接种在不同NAA浓度的培养基上培养28d，观察其生根的情况。试验设计的9个浓度的NAA对岗梅无菌芽的根诱导不起作用，而且根据观察，随着NAA浓度的增加，无菌芽的褐化现象增多，此外，没有观察到明显的芽分化和伸长生长（见表9）。表9NAA对岗梅无菌芽生长状态的影响Tab.9 Comp