烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验方案.doc

烟草中淀粉酶活性与多酚氧化酶活性的测定淀粉酶活性的测定原理：根据淀粉酶水解淀粉产生的一系列还原性糖类可将3，5-二硝基水杨酸还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过溶液颜色的深浅可反映出还原性糖类的浓度，也就可以间接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法，通过标准曲线测定淀粉酶的活性。实验材料，仪器，试剂（1）.材料：烟草新鲜叶片组织（2）.仪器：a.分光光度计 b.离心机 c.恒温水浴锅 d.具塞刻度管 e.容量瓶（3）.试剂：a.标准麦芽糖溶液（1mg/ml）；精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解，定容至100ml。b.3，5-二硝基水杨酸（10mg/ml）；精确称取1g3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，待其溶解后用蒸馏水定容至100ml。c.1氯化钠溶液，称取5g氯化钠于500ml容量瓶中定容。 d1淀粉溶液；称取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的柠檬酸钠溶液中。实验步骤（1）.仪器药品的准备与配置；按实验需求，将所有实验中用到的器材（大型实验设备应进行检查，做好使用前准备工作）试剂准备好a.器材包括称量用到的分析天平以及电子天平，溶解用到的容量瓶（100ml；1000ml2），烧杯(包括100ml5和500ml1)，玻璃棒，量筒等，以及实验用的数支具塞刻度试管，将上述仪器洗净并用蒸馏水浣洗，同时检查分光光度计，离心机，恒温水浴锅等设备b按照要求将所需求的试剂按步骤配制好，贴好标签，待用c冷冻样品提前做好解冻工作（2）标准曲线的制作；取10支具塞刻度试管，分别编号，以1号为空白对照分别按下表加入相应试剂编号试剂123456789标准麦芽糖溶液（ml）0 2468101214163,5-二硝基水杨酸溶液（ml）222222222定容至20m1l00水浴锅反应5min 之后取出用流水冷却，以1号试管为空白调零点，在540nm波长下比色测定210号试管的OD540值，以麦芽糖含量（浓度）为横坐标，各浓度下的OD值为纵坐标，用坐标纸绘制标准曲线，求出回归方程。（3）酶溶液的提取；将样品分别编号，按以下步骤分别操作a称取2g样品于研钵中，加入少许石英砂和2ml氯化钠溶液，研磨成匀浆；b.将匀浆转入离心管中，并用6ml氯化钠溶液分次洗涤研钵，将残渣一并洗入离心管内，于室温下放置1520min，没隔数分钟搅动一次，使其充分提取c然后待全部样品按上述步骤完成后，一次性转入离心机内，以3000r/min的转速离心10min，将上清液到入100ml容量瓶中，定容，摇匀，贴上相对应于样品的编号，即为淀粉酶原液，依据实际情况做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活（4）样品淀粉酶活力的测定；对于每个样品进行一下操作取两支具塞刻度试管，编号为1和2，按下表加入以下试剂 试管编号试剂12样品酶原液（ml）20100水浴锅中煮10min样品酶原液（ml）021淀粉溶液（ml）2237水浴锅中反应10min3，5-二硝基水杨酸溶液（ml）22100水浴锅反应5min用蒸馏水定容至20ml，适当稀释后于540nm波长下测定OD值，以1号试管为空白调零分别对每个样品按上述（4）步骤进行检测，记录相关数据并计算结果，将数据汇总后做成表格， 其中样品淀粉酶活力=CVT/(WVsT)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。 对实验结果做出相应的分析和评价。样品编号OD值A=520.00 nm还原糖含量(mg/ml)酶活力(mg/g/min)WB-080.142 0.742 2.373 WB-110.170 0.919 2.941 WB-150.146 0.767 2.454 WB-190.243 1.381 4.420 WB-120.144 0.754 2.414 WB-180.214 1.198 3.832 WB-090.119 0.596 1.907 WB-13(1)0.280 1.616 5.170 WB-160.155 0.824 2.637 WB-170.147 0.773 2.474 WB-13(2)0.202 1.122 3.589 WB-200.257 1.470 4.704 WB-210.292 1.692 5.413 WB-100.154 0.818 2.616 烟草中多酚氧化酶活性的测定原理：多酚氧化酶在有氧条件下会将酚氧化为醌，醌在525nm波长下有较强的吸光值，通过测定525mn下的吸光值变化可测得多酚氧化酶材料，仪器，试剂（1）材料：烟草叶片组织（2）仪器：分光光度计 离心机 匀浆机 试管 吸量管（3）试剂： a. 0.05mol/L PH=5.5的磷酸缓冲溶液 b. 0.1mol/L的儿茶酚溶液 c. 质量分数为20的三氯乙酸 d. 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP） e. 质量分数为30的硫酸铵f.0.1mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液g.0.01 mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液实验步骤（1） 实验设备和用品的准备；备齐实验所需器皿，洗净并用蒸馏水浣洗，检查所用设备，做好使用准备工作，备齐实验所用试剂，按要求放置妥当。 （2） 酶液的提取；将所有实验材料进行分组编号，每组样品取2g，置于大研钵中，用 5ml磷酸缓冲溶液，研磨均匀，并用5ml缓冲液洗涤研钵，转入15ml离心管，4000r/min离心5min,取上清液加5ml质量分数为30 的硫酸铵，以4000r/min的速度离心15min，去沉淀，上清液转入40ml离心管再加质量分数为30的硫酸铵10ml， 4000r/min离心15min，收集沉淀，将所得沉淀溶于1ml0.01mol/Lph=6.5的磷酸缓冲溶液中，粗制成酶溶液，将所制酶溶液放于4冰箱中保存，直至所有样品酶制剂都做完成。（3） 酶活性的测定；对于每一组酶制剂，分别做以下操作 试管编号试剂一号试管（设3次重复）二号试管磷酸缓冲液（ml）3.93.9儿茶酚（ml）1137水浴10min100水浴10min粗制酶制剂（ml）0.10.137水浴10min100水浴10min将两支试管迅速放入冰水浴中，立即加入2ml的20三氯乙酸，以5000r/min的转速离心10min，收集上清液，并适当稀释，于525nm波长下测定其吸光值。按上述步骤测定每一组样品，记录OD值（4） 酶活性的计算；以每分钟内OD525值变化0.01为一个酶活力单位计算