MMP25在早孕绒毛和蜕膜中的表达及意义的研究.doc

MMP25在早孕绒毛和蜕膜中的表达及意义的研究作者：王莉,董白桦,苏士利,张岩,靳琼,高文娟单位：山东大学齐鲁医院 1. 妇产科；2. 临床基础研究所， 济南【摘要】 目的 研究基质金属蛋白酶25 (matrix metalloproteinase25，MMP25)在正常早期妊娠和自然流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达特点，探讨其在胚胎植入中的作用及其与自然流产的关系。方法 采用半定量RTPCR和免疫组化法检测60例正常早期妊娠和40例自然流产患者绒毛及蜕膜组织中MMP25mRNA及蛋白的表达。结果 MMP25mRNA在正常早期妊娠的绒毛及蜕膜组织中均有表达，且绒毛组织中MMP25mRNA表达水平随妊娠周数的增加逐渐上升，各孕周组间相比差异有统计学意义(P0.05)。自然流产组绒毛及蜕膜组织中MMP25mRNA的表达明显低于正常妊娠组(P0.05)。 正常妊娠组的绒毛组织中，MMP25主要定位于细胞滋养细胞和合体滋养细胞，并且随妊娠周数增加表达逐渐增强，与RTPCR结果吻合；自然流产组仅在合体滋养细胞中有表达，两组平均光密度分别为0.21±0.02和0.13±0.04，差异有统计学意义(P0.05)。蜕膜组织中MMP25主要在腺上皮细胞表达，自然流产组的表达微弱，两组平均光密度分别为0.25±0.13和0.21±0.12，差异有统计学意义(P0.05)。结论 MMP25表达变化与滋养细胞浸润能力相吻合，且蜕膜组织中呈阳性表达，推测其参与胚胎植入及胎盘形成过程中滋养细胞浸润活性调控及子宫内膜组织重构；自然流产患者MMP25表达水平降低，造成滋养细胞浸润能力下降，可能与自然流产的发生有关。 【关键词】 基质金属蛋白酶25；早期妊娠；自然流产；绒毛；蜕膜Expression of MMP25 in the villi and decidua of early pregnancy WANG Li, DONG Baihua, SU Shili, ZHANG Yan, JIN Qiong, GAO Wenjuan, SHAO Qianqian, QU Xun1. Department of Gynecology and Obstetrics;2. Institute of Clinic and Basic Medicine Research, Qilu Hospital of Shangdong University, Jinan 250012, ChinaTo study the expression of matrix metalloproteinase25(MMP25) in the villi and decidua of normal early pregnant and spontaneous abortion women and to find the possible function of MMP25 in embryo implantation and its relationship with spontaneous abortion. Methods Semiquantitative RTPCR and immunohistochemistry were used to determine the expression and distribution of MMP25 mRNA and protein in the villi and decidua of normal early pregnant and spontaneous abortion women. Results MMP25 mRNA expressed in the villi and decidua of the normal early pregnancy group and increased with an increase of pregnancy weeks in each group, also it was significantly increased compared with the abortion group, and the differences among each week and between the pregnancy group and the abortion group were significant (both P0.05). In villous tissues, MMP25 expressed in the cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts and increased with the increase of pregnancy week in the normal early pregnancy group, however it only expressed in the syncytiotrophoblasts in the abortion group, and the mean ODs of the two groups were 0.21±0.02 and 0.13±0.04(P0.05) In deciduous tissues, MMP25 mainly expressed in glandular epithelium cells in the normal early pregnancy group and was very weak in the abortion group, and the mean ODs of the two groups were 0.25±0.13 and 0.21±0.12(P0.05). Conclusions MMP25 may play an important role in embryo implantation and placentation. The decrease of MMP25 may relate to spontaneous abortion.Key words: Matrix metalloproteinase25； Early pregnancy； Spontaneous abortion； Villi； Decidua 胚胎植入和早期胎盘形成是人类生殖过程中的重要环节,十分类似于肿瘤的浸润过程，涉及到一系列细胞性活动，包括滋养层细胞和子宫内膜细胞增殖、分化，具有很强增殖能力的滋养层细胞不断侵入母体子宫内膜，同时伴随着子宫内膜组织结构的降解和重建，以及胎盘绒毛血管发生1。许多MMP家族成员在这些过程中发挥重要作用2。然而对于MMP25在胚胎植入过程中的表达模式及其作用国内外尚未见报道。本研究拟通过检测正常早期妊娠及自然流产患者绒毛及蜕膜组织中MMP25的表达分布情况，探讨其在胚胎植入和胎盘形成过程中的作用及与自然流产的关系。1 资料与方法1.1 研究对象及分组1.1.1 正常妊娠组 为2006年10月至2007年6月自愿来山东大学齐鲁医院计划生育门诊行人工流产的早期妊娠妇女60例。入选标准:身体健康、年龄2035岁;妊娠510周，彩超证实为宫内妊娠且见胚芽或胎心搏动;妊娠前3个月及妊娠后未使用过甾体激素;每孕周组各10例，共6组。1.1.2 自然流产组 为同一时间来山东大学齐鲁医院计划生育门诊行清宫术的自然流产患者40例。入选标准:年龄在2035岁之间;停经12周以内，彩超证实为宫内妊娠有孕囊未见胚芽或有胚芽未见胎心搏动;妊娠前3个月及妊娠后未使用甾体激素;排除子宫畸形、感染及内分泌异常，夫妇染色体正常，既往无自身免疫性疾病。 上述两组对象的年龄、孕产次构成比差异均无统计学意义，具有可比性。 1.2 材料1.2.1 绒毛和蜕膜组织 收取上述研究对象术后的绒毛及蜕膜组织经PBS液冲洗后置液氮中快速冷存用于RNA提取，另取适量组织4多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。1.2.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司，MMulv逆转录酶、Oligo（dT）、dNTP、Taq DNA聚合酶均购自Fermentas公司，琼脂糖购自Sigma公司。鼠抗人MMP25单克隆抗体为RD公司产品，羊抗鼠二抗、DAB显色试剂盒为晶美生物工程有限公司产品。引物序列：MMP25：上游引物，5′GCCCCAACTCCATTATGAGG3′，下游引物，5′GGGTTTCCTTGTGGGCTT3′；内参照βactin：上游引物，5′TTGCCGACAGGATGCAGAA3′, 下游引物，5′GCCGATCCACACGGAGTACT3′，以上引物由Invitrogen公司设计合成。1.3 方法1.3.1 逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测绒毛和蜕膜组织中MMP25mRNA的表达 采用Trizol一步法提取绒毛和蜕膜组织总RNA, Oligo（dT）为引物逆转录生成cDNA，PCR 扩增。PCR扩增参数：95?预变性5?min；94?变性30?s；57?退火30?s；72?延伸45?s，34个循环；72?75?min使反应完全,4?冷却。取10?μL PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，捷达凝胶扫描成像系统采集并处理电泳结果，以MMP25基因的PCR扩增片断灰度与βactin基因的扩增片断灰度的比值作为MMP25mRNA的表达水平的定量参数。1.3.2 免疫组织化学检测 将术后采集的绒毛及蜕膜组织立即置于4多聚甲醛液中固定24?h，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，片厚3?μm。按免疫组化试剂盒说明操作,简述如下:一抗(1100) 4?孵育过夜,二抗37?孵育30?min,DAB染色,苏木素复染,梯度酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片，显微镜下观察显色结果。用PBS代替一抗作为阴性对照，以排除非特异性染色。切片集中染色，以免批内、批间误差。 结果判定标准：MMP25阳性染色定位于细胞膜或/和细胞浆呈棕黄色，根据着色强度分为4级：无着色为阴性；浅黄色为弱阳性；棕黄色为阳性：棕褐色为强阳性。将免疫组织化学染色结果输入图像分析仪，在40×10的高倍视野下，每张切片选择具有代表性的5个阳性视野，选取空白区定标，分别测量两组绒毛和蜕膜组织中MMP25阳性部位的平均光密度(OD)。1.4 统计学处理 应用SPSS130软件进行统计分析，数据以±s表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用OnewayANOVA分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 MMP25mRNA表达的半定量分析 半定量RTPCR结果显示,在正常早期妊娠510周各孕周组的绒毛组织中均有MMP25mRNA表达，且随孕周的增加呈现一定的表达趋势：妊娠5周表达较低，随后表达量逐渐增加，各孕周组相比差异有统计学意义(见图1)。而自然流产组绒毛和蜕膜组织中MMP25mRNA的表达均低于正常妊娠组，相对表达量分别为0.17±0.06和0.11±0.02；0.26±0.07和0.11±0.03，两组相比差异有统计学意义(P0.05) (见图2，表1)。正常早期妊娠各孕周组绒毛组织中MMP25 mRNA的相对表达水平（略）3 讨 论 胚胎植入是胚胎与子宫之间时空上相互协调的过程,使胚胎在短暂的子宫接受期与子宫内膜贴附,随后滋养层细胞侵入内膜与母体底蜕膜共同形成胎盘,维持胚胎进一步发育3。近年的研究表明,流产患者存在胎盘滋养细胞生物学行为的异常尤其是浸润能力不足，导致胚胎植入过浅，可能是自然流产发生的机制4。在胚胎植入和胎盘形成过程中，滋养细胞的浸润是一个主动的生物化学行为，受多种酶、激素、细胞因子调节，如MMPs、孕激素、胰岛素样生长因子等,其中MMPs尤为重要，是胚胎滋养层侵入性标志,其基因或蛋白表达与滋养层细胞的最大侵入能力相吻合5。 到目前为止，至少有25种MMPs家族成员被发现，按照结构不同分为4类：间质胶原酶类、明胶酶类、基质溶解素及膜型基质金属蛋白酶类(membrane type MMPs,MTMMPs)6。有学者认为，MMP2及MMP9在孕早期滋养细胞的侵袭中起重要作用，是侵入过程的限速酶7。随着研究的进一步发展，作为MMPs家族成员之一的MTMMPs因具有激活其它MMPs及降解细胞外基质(ECM )的双重功效而在胚胎植入的研究领域中越来越受重视。Turskainen等认为MMP14(MT1MMP)可能是滋养层侵入的关键酶之一，它或许单独作用，或作为其它蛋白酶的细胞表面激活因子起作用8。 MMP25是MTMMPs家族的一个新成员，又称膜型基质金属蛋白酶(MT6MMP)或白细胞溶素，最初由PeiD等从人类外周血cDNA库鉴定出来，定位于16号染色体(16q13.3)9。MMP25具有MMPs家族的基本结构，如信号肽区域、前肽区域、催化区域、血红素结合蛋白区域，并具有一个独特的含弗林蛋白酶识别部位(RXKR)的结构区，在MMP25酶原激活时发挥重要作用10。实验表明，MMP25一方面能有效降解多种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分，包括 IV型胶原、明胶、纤维蛋白、层粘连蛋白等，另一方面可以激活酶原型MMP2为活性形式的MMP2，并可能受所有TIMP家族成员的严格调控11。为进一步探讨MMP25在胚胎植入及胎盘形成中的作用及与自然流产的关系，本研究分别采用半定量RTPCR法和免疫组化法对MMP25在正常早期妊娠及自然流产患者绒毛及蜕膜中的表达和分布情况进行了检测。 本研究实验结果显示，在正常妊娠510周各孕周组的绒毛组织中均有MMP25表达，并且随妊娠过程存在特殊的时间变化模式，即妊娠5周时绒毛滋养层细胞中MMP25表达水平较低，随后表达逐渐增加，于妊娠10周时达高峰，各孕周组相比差异有统计学意义(P0.05)。人类胚胎植入发生在妊娠第45周，随后滋养层细胞侵袭能力逐渐增强，于妊娠10周达高峰，且于妊娠中期终止12。本研究结果表明，MMP25表达水平恰好与滋养细胞侵袭能力相吻合，两者呈平行水平。提示此分子可能参与妊娠过程中滋养层细胞行为的调节。 本实验通过观察正常妊娠蜕膜组织中MMP25的分布结果显示，MMP25在蜕膜组织的腺上皮细胞呈阳性表达。在滋养细胞侵入母体子宫内膜过程中，型胶原作为细胞外基质的主要成分，主要表达于子宫内膜腺体和血管基底膜，它可通过提供一个酶解底物及保持侵入表型促进滋养层细胞对母体子宫内膜的侵入13。本研究结果表明，MMP25与其水解底物型胶原分布具有高度一致性，提示MMP25可能参与子宫内膜细胞外基质降解, 从而有利于绒毛滋养层细胞穿透母体子宫内膜。 另外，本研究观察到,与正常早期妊娠相比，自然流产组绒毛及蜕膜组织MMP25mRNA和蛋白表达均显著低于正常早期妊娠组(P005)。从分布情况来看，自然流产绒毛组织中细胞滋养细胞和合体滋养细胞排列稀疏，MMP25仅在合体滋养细胞呈弱阳性表达，而细胞滋养细胞则呈阴性表达，同时MMP25在自然流产蜕膜组织腺上皮细胞中的染色也较微弱。由于MMP25可能参与妊娠过程中滋养层细胞行为的调节，并且有利于绒毛滋养层细胞穿透母体子宫内膜，因此自然流产时MMP25表达减弱可能造成滋养细胞浸润严重受阻，导致胚胎植入过浅或胎盘形成不良从而引起自然流产的发生。 综上所述，本研究结果表明，MMP25表达变化与滋养细胞浸润活性呈正相关，蜕膜组织中表达于腺上皮细胞，其可能参与胚胎植入及胎盘形成过程中滋养细胞浸润活性调控及子宫内膜组织重构。而自然流产时MMP25的表达降低可能导致绒毛滋养细胞侵袭力不足，干扰胚胎植入，从而成为自然流产的发生原因之一。【参考文献】 1StaunRam E, Shalev E. 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