骨氧化状态的影响初榨椰子油卵巢切除的大鼠.doc

原生态椰子油对卵巢切除大鼠骨氧化状态的影响原生态椰子油（VCO），被发现由于其多酚含量高而具有抗氧化特性。本研究的目的在探讨处女椰子油对脂质过氧化的骨质疏松大鼠模型影响。3个月大的正常雌性SD大鼠被随机分为4组，每组8只：依次为基准组、假手术组、卵巢切除（OVX）对照组、及给予含8VCO饮食六个星期的 OVX组。氧化状态骨评估是通过测量脂质过氧化，丙二醛（MDA）的浓度，以及内源性的抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和在研究结束时胫骨中的超氧化物歧化酶（SOD）。结果表明，OVX-VCO组的MDA水平与对照组相比，有着显着的减少。且卵巢切除后用VCO治疗的大鼠还有相当高的GPX浓度。然而，OVX-VCO组的SOD水平与OVX对照组相比却增加了。总之，VCO不仅可以防止脂质过氧化，还提高了骨质疏松大鼠模型的抗氧化酶活性。1、引言骨质疏松症是一种慢性全身性骨骼疾病，特点是低骨量和骨组织微架构的损失，其骨骼变得薄弱和脆弱，致使骨折的发生率也随之增加1。据世界卫生组织（WHO），骨质疏松症被定义为：与年轻健康的成年人同性别相比，具有低于平均标准2.5骨密度（BMD）或低于成人的骨骼质量峰值（T-score）。绝经后妇女的T分数低于平均值以下，少于1个SD就被视为具有低骨质密度，在这个时期，她们患骨质疏松症的风险明显增加2。许多研究表明，氧化应激性在骨质疏松症的发病机制中起着重要作用，同时几个风险因素如吸烟，高血压与糖尿病都伴随着高水平的氧化应激性3, 4。在绝经期雌激素水平的下降，导致雌激素的抗氧化应激保护作用和活性氧种类的损失 5，6，其次骨骼中抗氧化酶的消耗7。活性氧（ROS）活性的增加使得肿瘤坏死因子-（TNF-），RANKL和M-CSF的快速增值，使蚀骨作用增强导致骨质流失7，8。氧化应激性，通过抑制成骨细胞分化阻止骨形成，同时降低成骨细胞的存活9，10。雌激素的缺乏降低了成骨细胞的活性，刺激破骨细胞活动最终导致进一步发展为骨质疏松症9。处女椰子油（VCO），由于其在提高机体防御对抗氧化应激中的作用已经引起了越来越多的人的兴趣。VCO不同于普通椰子油，因为前者含有更大量的生物活性成分如多酚，生育酚，甾醇，和角鲨烯11。已被证实VCO的抗氧化活性高于精炼椰子油12，13。VCO已被证明，能够提高抗氧化酶的活性，抑制大鼠体内的脂质过氧化14。VCO的有益效用已在各种实验模型中得到了验证。除具有抗炎，镇痛，解热作用15，椰子油还有抗病毒的作用，这就是它为什么能够降低病毒载量，并且增加艾滋病患者体内的CD4，CD8细胞总数16。VCO卓越的保湿性，使得它较初榨橄榄油更有效治疗特应性皮炎 17。然而，据我们所知，并无任何研究工作验证了VCO对骨的效用。在本研究中，我们使用卵巢切除大鼠模拟绝经后骨质疏松症，一种与氧化应激有关的状态。研究目的是，通过骨中脂质过氧化和抗氧化酶指数评估，来确定VCO对骨质疏松症大鼠的骨氧化状态的作用。2、材料与方法2.1 实验动物和制备。来自于实验动物资源单位UKM的32只，三个月大的、重为250-300 g的雌性SD大鼠，在驯化两个星期后，被随机分成四组，每组8只。两组大鼠卵巢切除且一组为阴性对照组，另一组用含8的VCO的大鼠饲料饲喂。假手术组，假手术但不去除卵巢。基准组在研究开始时被杀死。所有的老鼠除了VCO组进行正常大鼠饲料饲喂。大鼠被安置在室温下，每笼有足够通风和正常的12小时明暗周期，允许它们自由进水和食物。开始治疗两个周，历时六个星期。这项研究获得了动物伦理委员会的UKM的支持（UKM AEC：PP/FAR/2009/NORLIZA/24-FEBRUARY/250-2009年3月- 2010年7月。2.2 VCO饮食的制备。椰棕（椰子）被用来准备VCO。VCO的制备是在Nevin和Rajamohan的方法基础上稍作修改18。该磨碎的椰子和其中性的水混合在一起软化椰子。然后，椰子混合物被挤压成粘浆直到混合物中的所有乳白色粘浆被完全压榨出来。在那之后，粘稠的椰奶在室温下保存48小时，直到发酵过程发生。三个层的制作如下：在上层的粘稠的椰奶，初榨椰子油在中间，和在下层中的水。将该油轻轻舀出，过滤到一个容器中。 8VCO饮食的制备是用100克的大鼠饮食和8克VCO混合。2.3 卵巢切除术。将大鼠麻醉，通过腹侧的方法进行OVX组的双边卵巢切除术。在卵巢被摘除之前，将大鼠的输卵管绑起来。假手术组进行假程序，使卵巢暴露出来并仔细操作，但其完整性保持不变19。2.4 骨样品的制备。在六周后治疗后，用高剂量的二乙基乙醚杀死大鼠。剔除左胫骨附着的肌肉并保持在-80C，直到准备好对其的丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）测试。2.5 脂质过氧化测试。骨头的丙二醛（MDA）水平通过使用巴比妥检测试剂盒（美国化工公司，开曼）进行估测20。MDA表示脂质过氧化反应的最终产物。为了使骨样品均质化，将左胫骨在瓷研钵内研磨，称取25 mg骨组织并放入1.5ml的离心管中。与250 ml蛋白酶抑制剂（EDTA）的RIPA缓冲液溶液混合。然后将它定容至40 V，4C超声处理 15分钟获得匀浆。在那之后，匀浆在1600g离心10min后（西格玛Laborzentrifugen 3K30，奥斯特罗德，德国），取上清液并贮存于-80C。利用微孔板分光光度计在540 nm处测定MDA含量（MBC VERSA最大，美国），并且测试按照TBARS的测定试剂盒的说明进行。2.6 超氧化物歧化酶的测量。首先，将胫骨匀浆，按照以下程序：骨头在PH值7.4时，被灌注磷酸盐缓冲盐水中，除去全部血细胞或血块。然后，称取0.25g的骨，在冰上用研钵研碎。骨组织被放入含有2ml 20mM HEPES缓冲液（20mM的HEPES缓冲液，pH=7.2，每克组织含1mM EGTA，210mM甘露醇，和70mM蔗糖）的10 ml软管里。之后，将组织置于冰上用组织匀浆器匀浆。接着，该均匀混合物在1500g，4C离心5分钟，取上清液于试管进行测定。超氧化物歧化酶通过使用从美国开曼化工公司的氧化物歧化酶的检测试剂盒测定。SOD的测定是使用酶标仪（MBC VERSA最大，美国）通过分光光度法在540 nm处测得。该测定时根据超氧化物歧化酶（SOD）检测检测试剂盒指令进行20。2.7 谷胱甘肽过氧化物酶的测定。 GPX的测量是用来自美国BIOVISION公司的谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒21。对于同质化骨样品：称取0.1g置于10ml软管内冰浴。然后，0.2ml的冷分析缓冲液也被置于冰浴。之后，使用OMNI BEAD RUPTOR24均化样品50 s，随后它被置于冰浴中，直到温度降低。用微型离心机22R（Beckman Coulter公司台式冷冻微型离心机，德国）将混合物以10,000 xg在4C下离心15 min后，收集上清液于具塞试管中。GPX的测定是通过使用酶标仪（MBC VERSA最大，美国）测量样品在340nm处的光密度（OD）。该法是按照谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒进行的。3. 结果3.1骨脂质过氧化（TBARS）。骨的OVX-VCO组与OVX对照组相比，丙二醛（MDA）的浓度显著降低（P 0.05）。此外，OVX对照组与基准组和假手术组相比，丙二醛（MDA）水平显著升高（图1）。图1：该图显示了在不同的组大鼠MDA水平。相同的字母表示显着差异群体之间在P0.05。 OVX-VCO组（卵巢切除，饲喂处女椰子油组）。 OVX对照组（卵巢切除对照组）。Sham（假手术组）。3.2 谷胱甘肽过氧化物酶。与OVX对照组相比，OVX-VCO组骨中的抗氧化状态有明显的提高，这是由于在后者GPX（P 0.05）的浓度有着显著的升高。此外，与基准组（P 0.05）相比，OVX对照组的GPX水平有显著提高（图2）。图2：该图显示了在不同的组大鼠的GPX水平。相同的字母表示在P组之间的一个重大区别P0.05。 OVX-VCO组（卵巢切除并饲喂处女椰子油组）。 OVX对照组（卵巢切除对照组）。Sham（假手术组）。3.3 超氧化物歧化酶。 与OVX对照组相比， OVX-VCO组的SOD浓度增加，但这种变化无法准确统计。与基准组（P0.05）相比， OVX对照组的SOD水平显着提高（图3）。图3：此图显示了在不同的组大鼠的SOD水平。相同的字母表示在P组之间的一个重大区别P0.05.OVX-VCO组（卵巢切除并饲喂处女椰子油组）。 OVX对照组（卵巢切除对照组）。Sham（假手术组）。3.4统计分析。SPSS19版被用于数据分析。测试数据的常态用柯尔莫哥洛夫斯米尔诺夫正态性检验。通常，正态分布的数据使用单因素方差分析。这项研究结果表示为平均值SEM。4、讨论雌激素水平降低是在绝经后骨质流失的主要原因22。卵巢切除老鼠是被建议的研究对绝经后骨质疏松症的临床前治疗的动物模型23，由于卵巢切除术和绝经后骨的变化的状态是相似的。在这两种情况下，内源性雌激素水平的降低，导致在骨代换中使骨中的骨矿物质密度的损失和减少增加24，25。绝经后的骨质疏松症与氧化应激性和抗氧化防御系统的抑制作用有关22，使得成骨细胞和破骨细胞间的活动不平衡。以前，我们表明，VCO能够显著地改善卵巢切除大鼠的骨形态学参数，包括骨小梁数量，骨小梁厚度和骨小梁分离（未发表的数据）。在骨形态组织相容研究中的阳性结果指引我们进一步探究VCO对骨质疏松大鼠模型骨的氧化状态的影响，试图解释VCO在增强身体防御系统对氧化应激性和自由基的作用。本研究结果通过OVX-VCO组与OVX对照组的比较，谷胱甘肽过氧化物酶水平的显著增加，以及超氧化物歧化酶（SOD）水平的上升趋势，表明饲喂VCO后骨抗氧化状态的的显著提升。OVX-VCO组较低水平的MDA含量表明了抗氧化酶的积极效用。同样的，卵巢切除对照组的GPX水平和超氧化物歧化酶（SOD）水平的显著提升说明内源性抗氧化酶释放，来对抗骨的氧化应激性及自由基活性。尽管如此，这种抗氧化酶的提高无法抑制脂质过氧化，由此解释了OVX对照组的较高MDA水平原因。我们的研究结果表现出一些与绝经后骨质疏松妇女研究的相似性，利用一些抗氧化剂的参数，如总抗氧化能力（TAC），血浆超氧化物歧化酶（SOD）活性，过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶与正常妇女相比，有着明显的增加，但这种生理上提高抗氧化剂以防止骨质疏松症的发展是远远不够的 26，27。与此相反，一些研究表明，与健康妇女相比，绝经后妇女血浆中中GPX活性的显著降低 28，29。谷胱甘肽过氧化物酶具有减少脂质过氧化氢的重要作用，它打破了氧化链并且抑制自由基的释放30。德雷尔等 31报道，减少GPX的表达可以干扰成骨细胞功能和增强导致骨质疏松的骨损失。另外，经由成骨细胞中的GPX表达增加，来应对氧化应激反应32。VCO的预防氧化应激作用也表现在其他器官。VCO被证明与精炼椰子油和花生油相比，有卓越的微粒体脂质过氧化的抑制效果14。VCO激发抗氧化酶活性，并降低伤口愈合的丙二醛（MDA）和谷胱甘肽水平。这抑制了脂质过氧化，促进成纤维细胞亲增殖，新生血管形成和愈合过程33。此外，花生油或橄榄油混合VCO被证明可以有效地抑制LDL的氧化，激发肝抗氧化酶的活性34。 VCO的抗氧化活性是由于油中较高的多元酚化合物组分 11，14,35。Marina等估测VCO的总酚含量范围在7.78-29.18mg GAE/100g油，这明显高于经精炼，漂白，脱臭的椰子油35。在VCO中的主要多酚类物质是阿魏酸和对香豆酸35。Seneviratne 和Dissanayake (2008)亦发现了商业和传统的VCO中的阿魏酸，p-香豆酸和咖啡酸36。多酚是在摩尔基础上，比维生素C和E较强的体外抗氧化剂 37。阿魏酸的抗氧化性能已被证实。阿魏酸属于苯氧羧酸类38。Toda等39已经证明，阿魏酸具有清除超氧自由基的能力，且抑制由过氧化阴离子引起的脂质过氧化。超氧自由基能降解基质蛋白增强骨吸收，使骨骼脆弱，且容易被酶消化5。Ries等人40报道，一个超氧阴离子自由基清除剂，如甲磺酸去铁胺锰混合物（Desferal）可以降低超氧化物的产生和减少破骨细胞的骨吸收。 阿魏酸和超氧化物歧化酶的抗氧化作用等值，而此特性使得它作为抗氧化剂时，比咖啡酸和p-香豆酸优越 39。此外，阿魏酸与-生育酚39 有相似的脂质过氧化抑制效果。Castelluccio等 41报道，阿魏酸是作为抗氧化剂对低密度脂蛋白比抗坏血酸更为有效。似乎VCO的清除自由基作用和抗氧化特性都来源于阿魏酸。 阿魏酸的抗氧化能力，是由于它能够有效地结束终端自由基的链反应，因为任何自由基与阿魏酸分子碰撞都可以很容易地获取酚性羟基的氢原子，进而形成一个高度稳定的苯氧自由基化合物38。此苯氧自由基是无法启动或传播发生链反应。这种稳定性属于容易形成，且缺乏苯氧自由基反应。此外，在不饱和的侧链的苯氧自由基中有延长共轭，且未成对电子没有被连接到氧原子，但它可以在整个分子中移动 38。 很少有研究研究了酚酸对骨质流失的影响。Sassa等 42报道，阿魏酸通过激发成骨细胞，来增强油破骨细胞造成的骨流失的骨重建过程。而且阿魏酸提高了在绝经后骨质疏松大鼠模型血清中的雌激素、孕激素水平。Zych等43表明，咖啡酸和P-香豆酸增加了雌激素缺乏大鼠模型的血清中雌激素水平。作者认为，酚酸，如咖啡酸可能影响调控卵巢雌激素的释放的代谢途径 43。Folwarczna等44验证了酚酸类物质对绝经后骨质疏松大鼠模型骨质流失的影响，他们报告说，p-香豆酸对骨质量/体质量比，和骨的骨矿物质量/体质量有积极的影响。另一方面，酚酸类物质对卵巢切除大鼠骨中骨矿物质量/骨量没有任何效果。5、结论氧化应激和抗氧化之间的不平衡剂导致破骨细胞活性的增强和成骨细胞的活性抑制。饮食中富含抗氧化剂被视为预防和治疗绝经后骨质疏松症的一种新疗法。VCO可以防止骨质疏松大鼠模型的脂质过氧化和增加抗氧化酶。因此，补充像VCO的富含抗氧化剂的饮食，可为开发新的绝经后骨质疏松症替代疗法何预防骨折带来曙光。然而，为了获得更完整评价的治疗潜力安全按摩油，还待进一步研究。致谢感谢马来西亚国民大学的财政支持格兰特UKM-DLP-2011-067。参考文献：1 R. Baron and E. Hesse. “Upda