RAPD技术及其应用.pdf

生物工程进展 1992 V0 1 1 2 N 专 扣 汾 叮 论 丫 RA PD技术及其应用 惠东威陈受宜 中国科学院遗传所植物生物技术开放实验室 D N A分子水平上的多 一态 性检侧技术是进 行基因组研 究的基础 自 从1975年C r o d z i ck er 等人第一次利用R FL P 卫 estrieti 二 F r找g m e n tLength Polym o rphlsm 限制片段长度多态 性 进行腺病毒血清型突变体基因组作图以来 人们便开始广泛利用D N八分子水平上的多 态 性进行基因组遗传图谱构建 基因定位以及生 物进化和分类的研究 同时也发展了越来越多 的检测DNA分子水平多态性的技术 例如利用 VNTR V ariable N认mb e了 T a n d em R ep 邸t数 目可变的串重复序列 C A S Co u pled Am pli fic atio nan dSeq uenein g联合扩增测序 Satel l it eD N八等进行DNA 分子水平多态性 检测方法 199 0年Wil l反 a 爪s等人 i 第一次运用随 机引物扩增寻找多态性 D N A 片段作为分子标 记 并 将此方法命名为RAPD Ra nd omAm plified p o lym orphie DN A随机扩增的多态 性D NA 尽管R APD技术诞生的时间很短 但 由于其独到的检测D NA多态性的方式以及快 速 简便的特点 使这些技术已渗透于基因组 研究的各个方面 增产物通过聚丙烯酞胺或琼脂糖凝胶电泳分 离 经EB染色或放射性自显影来 检测扩增产 物D N A片段的多态性 这些扩增产物D N A片 段的多态性反映了基 因组相应区域的 D NA多 态性 RAPD所用的一系列引物D NA 序列各不 相同 但对于任一特定的引物 它 同基因组 DNA序 列有其特定的结合位点 这些特定的 结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR扩增反应的条件 即引物在模板的两条链 上有互补位置 且引物3 产端相距 在一定的长 度范围之内 就可扩增出D N A片段 因此如 果基因组在这些区域 发生D NA片段插入 缺 失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分 布发生相应的变化 而使PCR产物增加 缺少 或发生分子量的改变 通过对PCR产物的检测 即 可测出基因组D N A在这些区域的多态性 由于进行R APD分析时可用引物数很大 虽然 对每一个引物而言其检测基因D NA多 态性的 区域是有限的 但是利用一系 列引物则可以使 检测区域几乎覆盖整个基因组 因此RAPD可 以对整个基因组D NA进行多态性检测 这就 是R A PD检测多态性D N A的原理 RApO技米及原理 RAPD技术建立于PC R技术基础上 它是 利用一系列 通常数百个 不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核昔酸单链 通常为十聚体 为引 物 对所研究基因组O N A进行PCR 扩增 扩 RAPD在基因定位及为R FLp连锁间隔区导 找新标记上的应用 RAPD可 以利用一系列引物对整个基因组 进行D NA多态性分析 一般来说 R APD能在 一1一 一次反应 中检测基因组的多个位点 因此它可 快速寻找两组 D NA 样品间多态性差异 进而 得到与此差异区域相连锁的 D N A 标记 这样 利用R APD即可定位在某一特定D NA区域内 特定基因 目标基因 也可为R F LP连锁图 上某一 区域增加新的D N A标记 利用R A PD进行基因定位 根据样品来 源可用如下两种方法 一 近等位基因系的基因定位 近等位基因系是由提供 目标基因的供体亲 本同轮回亲本杂交 并多次回交 经每代对目标 基因选择而获得的 除目标基因外其余性状大 部分都同轮回亲本相同的品系 因此 其基因 组D N A除目标基因所在区域同轮回亲本不同 外 其余部分则基本相同 这样就可利用R A PD 对这两个基因组一轮回亲本和近等 位基因 系 一DNA进行多态性检测 找出两个基因组扩增 产物的 差异 以这些差异产物为标记 经R F LP 分析即可定位此基因 T a n ks l ey 5 利用番茄近等位基因系 Rio G r a n d e 一Pto同其轮回亲本R 10 G r an de 寻找抗Pt o P seu d o m on assyrin g a e PV 基因多态性标记 用1 4 4个1 0 碱基 引物通过 RAPD对两个基因组进行多态性D NA 检测 找到 7 个多态性 DNA 片段 从中随机选 4 个 进行Pt o连锁分析 其中找到 3 个DN A标记 S R 和R S 同Pto 基 因连锁 并经RF LP 遗传分析 把这三个标记定位于RFLP连锁图 上 虽然P t 基 因已经定位于番茄RFLP连锁 图上 但T an k sl ey的实验证明用R APD 进行基 定位是完全可行的 二 利用对目标基因有分离的 F 群体进 行基因定位 用近等位基因系进行基因定位必须花费很 长的时间进行杂交 回交和选择来获得近等位 基因系 为了提高效率 K e ss eili 6 提出了 利用杂交后代F 群体进行基因定位的方法 即 BSA B u lkedSeg rega nt A na ly sis混 合分离 个体分析 原理 根据F 代个体中目标基因的 分离构建D NA库 DNAPo ol 如有F 有 交后代F 则可进一步从F 3 判断出F Z 个体就 所研究的 目标基因而言是否纯合及其等位基因 是否纯合 如抗病性基因可分为纯抗和纯敏 感 这样将F 分成两组 分别随机取1 0一2 0 株 分别提取DNA并等量混 和在一起 这样就 构成了两个DNA库 由于这两个DNA库对在 目标基因而言是经选择的 而其余部分则是随 机选择的 因此这两个D N A库在目标基因所在 DNA区域完全不同 而其余区域则近似相同 这样通过RAPD即可找出同目标区域相连锁的 DNA多态性标记 进而定位此基因 如果没有F 个体 自交后代 F3 也可用上述 方法构成两个百NA库 但由子显 性基因的 DNA库 中混有隐性基因 一因 此只有 一同 显性基 因相同连锁的D NA标记能被寻找到 一 K ss e i l i 用葛首对Dm s 8 棉疫病 抗 性基因有分离的 F Z群体为材料 将F Z 群体中 经F s鉴定分成对棉疫病抗性纯合子和敏感纯合 子两组 分别构成两个D N A库 用30 0个引物对 这两个D NA库进行RA PD检测 找出 三个多 态性D NA标记0 FR 140 0 OHD4800和O PH15 196 0同Dms 8 抗性基因连锁 并经过R FL P 分析把Dm s 8 基因定位于葛首R FLP连锁图 上 一 乙 朱立煌等利用水稻双单倍体 DH 群体 构建对稻瘟病纯抗和纯敏感的两个DNA库 用 15 0 个引物对这两个D NA库进行了多态性 检 测 发现两个引物产生的 D N A 片段 在 两个 DNA库中呈现多态性 利用这两个引 物扩增 出的差异D NA片段做探针 一 通过RF LP分析 发现引物BP12 7所产生的多态 性DNA片段分 别位于染色体8 B P12 7A 和染 色体 1 BP12 7 B 上 其中BP 12 7 A 与稻瘟病连锁 并定位于 染色体8上的R Z61 7 和R G2 8两个标记之间的区 域 内 从而定位了水稻抗稻瘟病基因于R F LP 连锁图上 利用R APD快速寻找 同某一 区域连锁 D N A标记的方法 可以为R FL P连锁间隔区提 供新的D NA标记 或增 加 RFL P某一区域的 DNA标记数 寻找某一R FLP间隔区新DNA 一2一 标记的方法与用BSA法定位基因 的过程 相类 似 只是D NA库的构建不是根据基因的情况 而是利用R FLP作图群体中的 R FL P分析情况 构成 也即根据某一区域两端D NA 标记的多 态性差异来构成 然后经R APD寻找落入此区 域的新的D NA标记 A ID P 一 A IDP 一B IDP 一 C和D P 一D 图l人 进行 了多态性检测 找到了3个D NA标记 30 7N 38 148 其中3o7N落于所需添补的i7 2CM 的间隔 38 在所添 补区域附近 14 8 则远离间 隔区 由此可 以看出利角RAPD增加R FL P某 些区域DNA标记的数目完全是有效的 RAPD 在基 因定位和对RFLP连 加 护阮 t 一 护0 01 皿 38 CT I胡丁 G 52 314盆JP巨 1 3盯 CT I叨 T G 52 314 J 护0 01亡 护阮 侣 溉 C T1630 们陌C T 125 C门1 34 锁图间隔区增加新标记 上 的 应用 可使人们定向寻找或增加某一D N A 区域RFLP标记 这为增加RFL P连 锁图中某一特定区域DNA标记的密 度创造了条件 为从连锁标记到基因 的寻找奠定了基础 这是用其它方法 进行此项工作难以达到的 Prim e r CT 269A CT 16 3 07N 38D C hrom OS6n e 1l Il I0 CT125 148B CT 2 3 4 38 CT168 内j凡j丹 乙 飞 J J TG523 307D CH10 CH11 R APO在基因组指纹图谱构建及 基因组遗传作图上的应用 由于R APD能对整个基因组进行 多态性检测 因此也可用于进行基因 组指纹图谱的构建 并利用指纹图谱 进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系 和系统进化的发育研究 M e Cl e lla n d 2 3 用三个 引物 Kpn 一R Al n 27 8 Clni对鼠 的8个 品系进行指纹图谱构建 并用Kp n R 和pBS两个引物对链球 菌的 n个 生 理小种 水稻的 3 个 品种和葡萄球菌 5 个种的2 4个生理小种进行了指纹图 谱构建 他们所获得的指纹图谱各不 图1 A Po olA Po oIB Po olC PooID 构成 1 纯合L es eulentu m等位位 点 2 杂合子 3 纯合L p en e l 川等位位点 B 多态性ONA标记在遗传图谱中排列 顺序 38 和307N为引物3 8D和3Q 7D扩增出的新D NA多态性标 记 T an k sle y 7 对番茄RFLp连锁图向隔区 图l B 进 行了新标记的寻找 利 用 20 0 个引 物分别对番茄作图群体所构成的 4 个D N A库 相同并且相当稳定 因此利用这些指纹图谱可 对这些种 生理小种 品系 和品种进行鉴定和 系谱分析 G a ry K oe he rt等人 4 利用10个引物 对花生的2 9个野生种基因组分别进行了PAPD 检测 并根据十个引物在2 9 个野生种基因组扩 增产物经电泳产生的图 谱中D NA条带的统 计 利用PAUP程序对这些数据进行分析建立 了这2 9个野生种的亲缘关系图 图2 并应用 Hy p e rR FL P程序分析了这2 9 个野生种的相对 遗传距离 图3 这些结果表明利用RAPD 一各一 获得的2 9个野生种进化和分类结果 与经典方法 得到的结果基本一致 利用RAPD构建和分析基因组指纹图谱还 可直接进行基因组遗传作图 M o C le l l a n d利用 RAPD技术构建T鼠C57BL 6J x DBA ZJ重 组近交系个体及亲本基因组指纹图谱 他用一 个引物K pn 一R 定位了 4 个多态性 位点 引物 Kp n一R 在亲本 CS认B L 6 J和D B A 2 J间用 RAPD检测出Kp n 一 360 Kp n一310 K pn 一23 5 A p 30 0 卜 A pa 贻 3007日 A 叩 3 0 6盯 A名p 30 0 3 Agla odol i化r 3 00 99 名laod ul ir cr 30 0引 A c o rrolin 3 500 一 A名p 6326 AJp 3 00里7 A上o r比nt nu 83 0 A c arde asii 一00 一 A s p 宁62 A ten o perm 4 o A 加clodc 6331 A落p 30005 人 rr cntin 9530 刀11 10 a 2 25 5匀 A为ati之 oeos 30 081 人为a t住oc of 9礴84 A s p 100 0 6 A刁 犷 09 百 300 0 J A p 3600 5 人 p 30 0 92 人 石ega之 之三 三 i 100 35 A 刁匕二 r 盆 ncn s 79 8 人 p 30 Q84 A sP 佰3 52 人才言吕 o nii 的34 人 p 300 盯 图2 PAU p计算机程序分析的2 9 个花生 野生种系统分化 的亲缘关系 K pn 一 185和Kp n一1 15六条多态 性D N A片段 其中K p n 一 1 8 5和Kpn 一 1 7 5两个片段在重组近交 系后代个体中表现为同一位点的长度多态性 其余则表现为条带有无的多态性 一 除K pn 36 0 同原已建立的遗传图谱中的D N A标记未表现 出紧密连锁外 其余的经统计分析皆定位于遗 传图谱上 M eC lella n d 2 直接利用R A PD进行 图3 Hyper RFLP计算机程序分析 的2 9 个花生野生 种相对遗传距离 遗传作图 为基因组作图提供了一种崭新的方 法 它同R FL P遗传作图 重复序列基因组作 图相比 不需要预先克隆标记或进行 序列分 析 而是直接完成多态性D N A标记的 寻找 并同时完成对这些多态性标记的遗传作图 这 使 得基因组遗传作图变得容易且又快速方便 RAPD在基因组研究方面表现出其独到的 特点和优势 首先 它在基因定位上 可以快速 定 向寻找同所定位基 因相连锁的 D N A标记 进而快速完成此基 因定位 这是利用随机克隆 R FL P进行基因定位所不能做到的 并 且它还 可以有效地定向增加R FL P某一区域D NA标 记 第二 R APD可以在对物种没有任何分子生 物学研究的情况下 对这些物种进行基因组指 纹图谱的构建 并且通过统计分析为物种进化 和分类研究提供D N A分子水平的证据 这是 利用其它方法 如 R FLP VN TR等方法 进行此类研究所不能做到的 第三 R APD可 直接对基因组进行连锁标 记作图 它避开了 R F LP和重复序列基因组作图必须首先要进行 DNA标记克隆 多态性筛选或测序分析等一 系列准备工作 第四 R八PD由于其引物为人 一4一 星定序合成的 并且这些引物对任何基因组研 究是通用的 因此适合于大规模生产和商 品 化 这大大降低了研究费用 RA PD建立于PC R基础之上 它继承 了 PC R的优点 即样品用量少 灵敏度高 检测 容易等 但 也同时保留了PCR所固有的缺陷 即易产生假带 虽然这些假带可以通过重复试 验加以排除 但对于大量样品的检测 重复实 验则带来一定的麻烦 另外由于RAPD所用引 物通常比一般PC R反应引物短 这进一步增加 了重复实验的难度 但是通过严格控制实验条 件 还是能够得到可靠的重复结果的 另外 RAPD所用引物短 有时产生的多态性D NA 电泳图谱比较复杂 会给实验分析检测结果带 来一定的困难 但是尽管如此 一 RAPD检测的 快速 简便的特点仍将使得它在基因组研究中 发挥更大的作用 参文考献 1 W illiams J G K K ubeljk A R Liv akK J R a alsk i J A Ting ev 5 V D N A Polymo rPhism s am Plifiedby arb itrary Pr im ersare us eful as ge n etiemarkers N uel A e id sR e s ts 6531一6535 1990 2 W els hJ Peter s o n C M cClelland M Polym orPhisms g enerated by ar bit r a rilvPrimed PCSin the m ou s e aPPlie ation to strain 泛 de ntifl e a tio na n dg e n etie m aP Ping N u el A eids R os 19 303一06 1991 3 W t ls hJ M eC lella一zd M Fing e rPrinting g eno m e su sin gP C Rw ith a rb itra ry Prim e rs N uel A eids R es 18 7 213一72t8 1990 4 Halw ard r Stalk e r T L aRu e E Ko e he rtG U se of sin g le一Prim e r DNA am p lifiea tio ns511g e n e tiehstud ie s o f p e an ut A r a ehis ypog a ea L Pla ntMolee ul ar Biology 8 下转第2 7页 DN A 重组碱性成纤维细胞生长因子的研究与开发 林剑 暨南大学生物工程开发中心广州5工0632 碱性成纤维细胞生长因子 Ba s i c F ib r bla st G ro wthFa ctor b FG F 和其它细胞因 子一样是哺乳动物和人体 中一种正常的非常微 量的物质 然而生理功能却非常广泛 在临床 上有重要价值 早在19 40年 Ho ffm a n 等就已经在脑和垂 体提取物中发现一种能够促进成纤维细胞生长 的物质 7 0年代又 重新在上述组织中部分纯化 这些提取物 发现它是成纤维细胞的一种有丝 分裂原 m it ogen 29 7 5年定名为成纤维细 胞生长因子 FG F 并初步确定了它的理化 性质 1984年 B o hl en 等人已高度纯化bFG F 牛的垂体bFGF的完整的氨基酸顺序由E soh 1985 和Sim ps o n 195 7 等人完成 A b ra ham等人在1986年获得了bFG F的 eD NA 克 隆 从此bFG F的研究进入DNA重组阶段 现就b FG F的理化性质 生物学特 性和临 床效果作简略介绍并谈谈我们在 研究和开发 bFG F的一些体会 一 一般理化性质 1 F GF依据其等电点不同 可以分为酸 性F G F aF GF 和碱性F GF bF G F bFGF 等电点为9 6 两者不是同一基因产物 aFGF 基因位于人的第 5 对染色体 b FGF位于第4 位染色体 但其氨基酸约有5 5 同源 都为单 链结构 b FG F活性比aFG F大10倍 100倍 2 分子量1 7 一 ZOK D 酶切N端部分氨基 一5一 或者利用连续表达有关致病蛋白的转基因植 株 正义R NA s 利 用 特 异的 正 义RN A s是 由 Mo rc h等人于19 87年提出 的 且已利用 单链 的RNA病毒一芜普黄色 花 叶病 毒 T YMV 作过体外试验 认为R对入病毒的3 端区域是提 供该病毒复制酶识别的位点 已用其相 应于 T YM v 3 端区 域的 D NA片段来生产这种 相 向 链的小R N A s 或似基因组的片段作为该病毒的 基因组 当把其加进体外复制系统中时 TYMV 的复制受到巨大抑制 而不含有 这 种病毒 3 端区域的其他短小R N As 却没 一有 这种 作 用 这说明 在似基因组片段的R NA与TYMV 的R N A之间存在着为连结到其复制酶上而 进行竞争的机理 缺陷干扰RNA 缺陷干扰 R N A s D RN A s 和卫星R NA s在它们都是依赖 辅助病 毒来复制且能减轻发病症状方面是相似的 但 与卫星序列所不伺的是 它的确与这种辅助病 毒享有序列同源 DI R介人s都直接来源于病毒 的基因组 但在序列中有不连续体 这是在研究 番茄丛矮病毒 TB Sv 时发瑰的 D IRNA s 分 子可能是通过竞争方式 千扰了辅助病 毒的 合成 从而减轻了病状 这些性质使得利用现存 的D l RN A s或构建新的D l R NA s 成为可能 与致病相关的蛋白的表达与致病相关 的蛋白 PR蛋白 来源 于寄主而不是病毒 所以其利用上有别于上述任何途径 PR 蛋 白 的有加个种类 在许多植物中 它随对病原体 种类的入侵反应而提高 已清楚几种PR蛋白 都是水解细胞壁的降解酶类一一壳多糖酶和 日 1 3 萄聚糖酶 其中有一种是与TMV的 杭性有关的 但与抗性有关的酶类是如何参与 防御病毒入 侵的机 理还不清 楚 最近 在 C a MV3 5S启动子的调控下 已把3种不同的 PR 蛋白的基因单独地导入烟草 植 物中 一种 为PR一 1 蛋白 功能还不清 楚 另一种为 PR一S蛋白 它与