重组克隆的筛选.ppt

重组克隆的筛选 1 抗性筛选 2 蓝白斑筛选 3 酶切电泳筛选 4 PCR筛选 5 测序验证 6 表达筛选 7 生物活性筛选 抗性筛选 质粒载体携带的筛选标记 1 AmpR 氨苄青霉素抗性 2 TetR 四环素抗性 3 KanR 卡那霉素抗性 特点 一般用抗性培养基做初级筛选 只能保证有载体转入 不能保证外源基因插入 克隆的Amp抗性筛选 蓝白斑筛选 半乳糖苷酶 LacZ 的显色反应 一 互补 LacZ由4个亚基构成 细菌表达一部分 无活性 载体表达一部分 无活性 合在一起构成有活性的LacZ 可分解培养基平板中的底物X gal 生成蓝色物质 需要IPTG诱导表达 蓝斑 二 外源基因插入载体后 使载体部分LacZ失活 无法进行 互补 白斑 三 特点 1 未转入载体的细菌也会形成白斑 需同时用抗性筛选 2 无法确定基因插入的方向 3 特殊 基因过小 且读框正确 可能无法使载体部分LacZ失活 将产生 互补 产生蓝斑 酶切电泳筛选 一 选用不同的酶切组合 通过电泳检测DNA片断的大小 二 特点 1 可鉴定外源基因的重组和插入方向 2 结果可靠但操作比较麻烦 3 无法检测基因内部的突变 EcoR1和Xho1双酶切筛选 PCR筛选 1 通过特异引物扩增 电泳检测 筛选重组质粒 二 特点 1 可用2ul菌液做模板 快速 方便 可批量检测 2 不能检测基因插入方向3 不能检测基因内部突变 测序验证 一 选取阳性克隆 送公司测序 二 特点 1 最可靠的检测方法 可确定基因的重组 插入的方向 基因内部的突变等 2 价格贵 适于1 2个克隆的验证 1 一次测序反应一般准确测定500bp左右 也有测准800bp 价格贵 60元左右 2 测定的序列靠近引物 起点 20 30bp不准 500bp后的序列也不准 3 1 质粒测序 测序引物公司提供 2 PCR产物直接测序 测序引物自己提供 理论上比质粒测序更可靠 注意 A 测序引物必须与模板完全配对 含有mix碱基的引物一般不能测序 B 测序引物长度一般为20个碱基左右 GC含量必须在50 60 左右 一 测序图谱分析 判断测序结果可靠性二 测序序列的分析 注意 有时序列是反测的 需要先把序列反转后再同源联配 用VectorNTI 表达筛选 一 SDS PAGE筛选 二 亲和筛选 三 免疫筛选 SDS PAGE筛选 1 小量诱导表达 2 全菌液裂解后进行SDS PAGE电泳 3 重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带 需加不诱导的对照 特点 1 可检测外源基因的表达 一般基因的插入 方向 读框都正确 2 无法筛选不能有效表达的重组质粒 亲和筛选 1 50ml菌液诱导表达 2 超声破菌 3 用少量亲和beads吸附上清 4 SDS PAGE检测 在特点位点将出现一条蛋白带 特点 1 适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测 2 比SDS PAGE筛选更灵敏 富集 可靠 3 比较麻烦 免疫筛选 用抗体检测目标蛋白 Westernblot 最准确 ELISA 可能会受到交叉反应的干扰 生物活性筛选 酶 测定酶活 亲和蛋白 与亲和底物作用 其它的生物活性 分子克隆流程 1 分析基因 载体特点 2 设计克隆策略 3 检测基因 载体的正确性 4 制备感受态细胞 目的基因 载体 5 连