胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种引起的黄瓜细菌性软腐

2017年 第7期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 7 1前言 黄瓜 Cucumissativus L 是一种广泛种植的葫 芦科 Cucurbitaceae 植物 据统计 中国是世界上最 大的黄瓜生产国 2013年收获面积为117万hm2 产 量为5 436万t 粮农组织 2016年统计数据 http faostat3 fao org download Q QC E 然而 在其生长过 程中 黄瓜易感多种病害 2014 2015年 中国山东 山西 河北 河南和辽宁等地暴发黄瓜细菌性软腐 病 不同田块的发病率从15 到50 不等 造成 20 30 的产量损失 细菌性软腐烂被认为是由胡萝卜软腐果胶杆菌 Pectobacterium carotovorum 引起 该病原菌通过产 生大量果胶酶 1 浸渍植物的薄壁组织 导致多种蔬 菜作物和观赏植物的软腐病 黑胫病和枯萎病 2 4 胡萝卜软腐果胶杆菌 Pectobacterium carotovorum 包括3个已命名的亚种 即P carotovorum subsp carotovorum 5 P carotovorum subsp odoriferum 6 和 P carotovorum subsp brasilensis 7 其中 P caroto vorum subsp brasilensis Pcb 在巴西首次被报道为 马铃薯黑腐病的病原菌 7 近期则被发现是侵染韩 国红辣椒 8 及美国 以色列 肯尼亚 新西兰 瑞士和 南非的马铃薯 2 9 13 的致病菌 然而 并无有关Pcb引 起黄瓜细菌性软腐病的报道 胡萝卜软腐果胶杆菌菌株的生化或遗传特性在 同一亚种内仍有所分化 14 因此仅使用表观研究 生 物化学研究或16SrRNA序列分析难以准确鉴定该 病原菌 由于多位点测序分析 MLSA 可能为细菌的 物种形成提供更好的解释 15 且已被证明是区分胡 萝卜软腐果胶杆菌菌株最可靠的方法之一 16 近年 胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense 引起的黄瓜细菌性软腐病在中国发生 冯志琴译 农业部规划设计研究院 农业部农产品产后处理重点实验室 北京100125 摘要 2014 2015年 在中国山东 山西 河北 河南 辽宁等省的黄瓜茎叶上发生了毁灭性的细菌性软腐病 造成 了黄瓜产业严重的经济损失 黄瓜叶片 茎 叶柄和果实表面出现流胶 茎基部呈深褐色进而出现湿腐 受侵染的黄 瓜叶边缘出现黄斑和湿腐症状 并逐渐扩散至叶片中心 从受侵染组织中分离出45个细菌菌株 在形态学特性鉴 定 生理学 生物化学和16SrRNA基因序列分析的基础上 将病原体鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌 Pectobacterium carotovorum 多位点序列分析 MLSA 证实 分离菌株是胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 Pectobacterium carotovorum subsp brasiliensis Pcb 病原菌归入进化枝II 重新分离获得与原始菌株相同的菌株 证实了分离菌株的致病力 寄主范围测试表明 该菌株具有广泛的寄主范围 目前为止 这是对Pcb引起的黄瓜软腐病 这一对黄瓜生产具 有重要经济影响的病害在中国乃至全球范围内的首次报道 关键词 胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 Pcb 黄瓜 软腐 流胶 多位点序列分析 MLSA 寄主范围 中图分类号 S436 421 1 9文献标识码 B文章编号 1672 6820 2017 07 0058 05 译者简介 冯志琴 高级工程师 主要从事种子加工及相关专业技术研究与咨询工作 E mail 867714630 译自 Plant Disease 2017 101 2 279 Emergence of bacterial soft rot in cucumber caused by Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense in China Meng X L Chai A L Shi Y X Xie X W Ma Z H Li B J 致谢 本研究得到了中国农业科学院科技创新工程 CAAS ASTIP IVFCAAS 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室的支 持 受国家现代农业产业技术体系建设项目 CARS 25 资助 58 2017年 第7期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 7 来 基于MLSA的分类研究被引入胡萝卜软腐果胶 杆菌菌株 10 17 鉴定工作中 本研究旨在对近期于中国山东 山西 河北 河 南和辽宁的黄瓜上发生的软腐病相关细菌进行分离 与鉴定 使用生理和分子生物学等分析技术 看家基 因的多位点序列分析 MLSA 及针对黄瓜和不同寄 主植物的致病力测定 判定该病原菌的有效性 2材料与方法 2 1样品采集和菌株分离 2014年11月至2015年3月 对山东 山西 河 北 河南和辽宁省20个温室的黄瓜进行了田间症状 调查 在18个温室中采集到约68个表现出流胶 软 腐或黄斑的样品 其中 果实15个 茎22个 叶31 个 49个样品 果实9个 茎16个和叶24个 被用 于分离和鉴定 另有17个样品 果实4个 茎6个和 叶7个 被作为标本存放在中国农业科学院蔬菜与 花卉研究所 供今后参考 为分离病原菌 将受侵染 组织在75 乙醇中表面灭菌30 s后 用无菌蒸馏水 冲洗 然后用无菌手术刀在1 mL无菌蒸馏水中对 其进行研磨 将研磨后的组织浸泡3 min 并用10 L悬浮液在营养琼脂 NA 培养基上划线 从感染 组织中获得了45个具有相同菌落形态的分离株 随 机选择了9个菌株用于以下研究 2 2表型和生化特征 使用Microlog系统 Biolog Inc CA 进行碳源 利用的研究 根据厂商的建议 在GN2微孔板中对 9个选定菌株对95个碳源的氧化反应进行测定 在 27 下 在微孔板内按150 L悬浮液 孔进行接 种 此外 全部菌株均按照一般针对果胶杆菌的标准 测试进行表型鉴定 包括结晶紫果胶 CVP 培养基 上的果胶活性测试 麦芽糖和 甲基 D 葡萄糖苷 的酸产量测试 蔗糖的还原物测试 37 条件下的 生长测试 红霉素敏感性测试 7 5 氯化钠耐受性 测试 乳糖发酵测试和D 葡萄糖产气测试 14 2 316SrRNA基因序列分析 使用通用引物27F 5 AGA GTTTGATCCTGG CTC AG 3 和1492R 5 ACGGCT ACC TTGTTAC GACTT 3 进行9个分离菌株的16SrRNA基因序 列扩增 使用含有引物各2 L master mix Biomed 中国 25 L 水19 L和5 g LDNA模板2 L的 50 L反应体系进行PCR PCR扩增程序包括95 预变性10 min 95 30 s 55 30 s和72 45 s 35个循环 最后在S1000TM热循环仪 Bio rad USA 中 72 延伸10 min 通过1 5 琼脂糖凝胶电泳 检 测扩增片段 并使用凝胶提取试剂盒 TIANGEN 中 国 从凝胶中纯化 测序由Biomad BigDye Termina tor ready reaction mix v31 Applied Biosystems 中 国 完成 序列以登录号KU997676 KU997684提交 至GenBank 将9个分离菌株和18个参考菌株的 16SrRNA序列在MEGA 6 0软件中进行比对 使用 基于Tamura Nei模型的最大似然法进行系统发育 分析 其中自举重复数设置为1000 18 2 4多位点序列分析 在多位点序列分析 MLSA 中使用八个特征看 家 基 因 mtlD acnA icdA mdh pgi gabA proA和 rpoS 从NCBI GenBank中检索了25个胡萝卜软腐 果胶杆菌菌株公开可用的看家基因序列 17 19 按照 前人研究的方法 对本试验中分离的9个菌株进行 8个保守看家基因片段的PCR扩增 17 测序由 Biomad BigDye Terminator ready reaction mix v31 Applied Biosystems 中国 完成 序列以登录号 KX010008 KX010079提交至GenBank 使用MEGA 6 0中的CLUSTAL W对看家基因序列进行比对 Tamuraet al 2011 对 各 部 分 基 因 序 列 mtlD 390bp acnA 300bp icdA 520bp mdh 460bp pgi 520bp gapA 450bp proA 630bp 和rpoS 880bp 的所有核苷酸位点进行系统发育分析 在 MEGA中构建了基于Tamura Nei模型 20 的信息最 大似然法 并进行了1 000次重复的自举测试 2 5致病力和寄主范围测试 为进行科赫法则验证 对黄瓜植株 中农16 的 果实 茎和叶片用1 次氯酸钠进行表面灭菌 并分 别接种Pcb菌株 使用培养自LB培养基 含有胰蛋 白胨10 g 酵母提取物5 g 氯化钠10 g 水1L pH 7 4 的HG1501090303 HG1501090306和HG15 01090309 从果实中分离 1 107CFU mL细菌悬浮 液各10 L 对黄瓜果实进行针刺接种 使用1 107 CFU mL的HG1501090304 HG1501090305 HG15 01090307和HG1501090310 从茎分离 细菌悬浮液 59 2017年 第7期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 7 各10 L对黄瓜茎进行针刺接种 使用1 107CFU mL的HG1501090302和HG1501090308 从叶分离 的细菌悬浮液10 mL对黄瓜叶片进行喷雾接种 每 个果实或茎刺伤3点 两个相邻刺点间距离为1 cm 将细菌悬浮液喷洒在每片叶的表面 使用灭菌 蒸馏水进行阴性对照接种 将接种后的果实和幼苗 在温度26 30 相对湿度98 的玻璃柜中静置48 h 之后 将接种后的果实和幼苗移出 在自然采光 温度15 17 夜间 26 28 白天 的温室中温 育 并每天监测是否出现症状 在具有典型软腐症状 的果实和幼苗上分离病原菌 于LB琼脂培养基上 培养 并将所得菌株的形态和生理特征与原始菌株 进行对比 接种试验重复3次 每次重复包括4个果 实和幼苗 用不同种植物测试了9个随机选定菌株的寄主 范围 每个接种物被针刺接种到15种植物的幼苗或 块茎中 包括5种葫芦科作物 黄瓜 西葫芦 西瓜 苦瓜和丝瓜 5种十字花科作物 白菜 芥菜 西兰 花 萝卜和甘蓝 3种茄科作物 辣椒 番茄和马铃 薯 1种苋科作物 菠菜 和1种伞形科作物 芹 菜 将从LB培养基中获得的9个随机选定菌株 以1 107CFU mL细菌悬浮液各10 L对收获植物 的块茎或盆栽植物 21日龄 的个体幼苗进行接种 每个幼苗或块茎各被刺伤3点 两个相邻刺点间距 为1 cm 用无菌牙签蘸取灭菌水进行对照接种 按 上述处理接种植物 接种试验重复3次 每次重复包 括4个植株或块茎 3结果 3 1受侵染黄瓜的症状及细菌分离 2014年11月至2015年3月 在山东 山西 河 北 河南 辽宁等省对黄瓜软腐病展开了调查 在20 个被调查温室中 受害率占90 不同地区的发病 率为20 50 在黄瓜植株上受侵染组织表面最初 产生白色浓稠液体 茎呈水渍状 后期症状为果实褐 腐 叶片边缘或中心湿润腐烂 随着侵染程度加重 茎逐渐纵向开裂 表现出软腐症状 从45个染病组 织样品中 共获得45种形态相似的分离物 且从平 板培养的组织上获得分离菌株的回收率为100 随机选择9个菌株进行以下研究 3 2生化和生理特征 9个菌株的生物化学和生理学特征 所有菌株 均能在28 和37 下生长 耐受5 氯化钠 且在 CVP培养基上可形成菌坑 所有菌株均为革兰氏阴 性兼性厌氧菌 根据生物学分析 95个被测碳源中 的35个可被所有菌株代谢利用 所有菌株均可将 甲基葡萄糖苷 葡萄糖和麦芽糖转化为酸 并利用 乙酸 纤维二糖 d 二聚二糖 d 山梨糖醇 琥珀酰胺 酸和胸苷 这些特征与Pcb公布的数据一致 7 13 3 316SrRNA基因分析 对选定的9个具代表性分离菌株的部分16Sr RNA区域的DNA序列进行了测序和系统发育分析 比对 对9个分离菌株的16SrRNA基因扩增 各得 到一段长1 400 bp的序列 基于16SrRNA的系统发 育分析 将27个菌株分为4个相似性水平 从中国 的黄瓜样品中分离出的菌株与Pcb具有99 的一 致性 并与Pcb和Pcc的部分菌株分为一组 分离株 与P wasabiae P arosepticum Pco Dickeya zeae 或Pseudomonas syringae pv lachrymans菌株的聚类 之间无明显关系 该结果表明 在中国的黄瓜上分离 到的菌株属于胡萝卜软腐果胶杆菌 3 4MLSA分析 为进一步鉴定在中国的黄瓜上分离所得选定菌 株的亚种水平 分别从9个分离菌株和25个相关分 类群体中分离出acnA gapA icdA mdh mtlD pgi和 proA 7个看家基因 用于MLSA分析 MLSA表明 Pcb菌株分为I和II两个进化枝 进化枝I由来自 巴西和秘鲁的菌株组成 包括模式菌株212T 进化 枝II的菌株则来自欧洲 亚洲和美洲 这与此前的 研究结果一致 14 从中国黄瓜上分离出的9个被试 菌株被归入进化枝II 而此前的MLSA研究 17 也表 明 Pcc菌株也分为两个类群 进化枝III和进化枝 IV Pco菌株被归为进化枝V 形成一个单独的同 源类群 结果证实 从中国的黄瓜作物中分离出的9 个被试菌株与Pcc及Pco不同 属于Pcb 3 5致病力测定 对从中国的黄瓜组织中分离得到的9个选定菌 株 对其引起原寄主黄瓜各组织软腐病的能力进行 了评价 接种24 h后 黄瓜幼苗茎上观察到软腐病 症状 与田间观察到的症状一致 在接种后4d 观察 60 2017年 第7期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 7 到黄瓜果实和叶片的症状与田间症状一致 用无菌 水接种的对照幼苗无症状 从病变接种组织中重新 分离的细菌 表现出与接种的原始分离菌株相同的 性状 3 6寄主范围测试 利用9个随机选定的菌株接种不同的寄主植 物 结果表明 除葫芦科的苦瓜和丝瓜外 所有被试 菌株均可在十字花科 白菜 芥菜 西兰花 萝卜和甘 蓝 茄科 辣椒 番茄和马铃薯 菠菜 芹菜和大多 数葫芦科作物 黄瓜 西葫芦和西瓜 中引起软腐 4讨论 根据形态学 生物化学 生理学特征和分子分 析 确定在中国山东 山西 河北 河南 辽宁等省的 黄瓜软腐病由Pcb导致 黄瓜细菌性软腐病是全球 范围内黄瓜作物上严重的细菌性疾病 2014 2015 年 中国山东 山西 河北 河南 辽宁等省发生该病 对当地黄瓜生产造成了严重的经济损失 由于症状 接近 该病害以往被认为是由丁香假单胞菌 Pseu domonas syringae pv lachrymans Psl 引起 然而 本研究证实 中国的黄瓜细菌软腐病的病原菌是胡 萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 Pectobacterium caro tovorum subsp brasiliense 致病力测定表明 从黄瓜病变组织中分离出的 菌株可导致茎和果实软腐 叶片湿腐 在高湿度条件 下 受侵染组织表面也可观察到菌脓溢出 分离菌株 的生物化学和生理特征与前人对Pcb 13 的特征描述 一致 从病变接种组织中重新分离的菌株 表现出与 接种原始分离菌株相同的性状 验证了科赫法则 基于16SrRNA基因序列分析 从中国的黄瓜植 株上分离的9个随机选定菌株与Psl明显不同 但 与无法与其他胡萝卜软腐果胶杆菌进行区分 这与 前人研究一致 进一步验证了部分16SrRNA基因序 列不能用于区分果胶杆菌的亚种 14 21 由于胡萝卜 软腐果胶杆菌亚种的高度多样性 MLSA被用于区 分该病原菌的各个亚种 较之DNA杂交和16Sr RNA基因系统发育分析具有更高的灵敏度 14 在本 试验MLSA结果的基础上 Pcb被划分为有别于Pcc 和Pco的独立系统发育群体 Pcb菌株分为I和II 两个进化枝 从中国的黄瓜上分离的9个随机选定 菌株属于进化枝II 进化枝II由来自欧洲 亚洲和 北美的菌株组成 此外 Pcc菌株也分为两个进化 枝 Pco菌株形成独立的同源类群 划入进化枝V 这证实了从中国的黄瓜上分离的菌株为Pcb 在MLSA进化枝II中的菌株遍布全球 寄主植 物不仅是马铃薯 还包括其他植物 14 寄主范围测定 显示 在候选植物中 除苦瓜和丝瓜外 所有植株均 被从黄瓜中分离的菌株感染 表现出茎软腐的症状 该结果与已发表的有关Pcb 9 的数据一致 表明造成 中国黄瓜软腐病的病原菌寄主范围广泛 该特征可 使病原菌通过寄生在其他植物或植物残留物中 以 利其在恶劣环境中生存 存活的病原菌可能成为次 年侵染黄瓜的主要菌源 综上所述 通过形态学 生物化学 生理学特征 鉴定 16SrRNA序列分析 MLSA和致病力测定 本 试验证实了从中国黄瓜上分离的菌株为Pcb 目前 这是有关Pcb引起黄瓜软腐病的首次报道 预计该 病害将对黄瓜乃至其他作物的生产产生重大的经济 影响 参考文献 1 P rombelon M C M Kelman A Ecology of the soft rot Erwinias J Annual Review of Phytopathology 1980 18 1 361 387 2 Hauben L Moore E R Vauterin L et al Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae J Systematic and Applied Microbiology 1998 21 3 384 397 3 P rombelon M C M Potato disease caused by soft rot Er winias an overview of pathogenesis J Plant Pathology 2002 51 1 1 12 4 Toth I K Bell K S Holeva M C et al Soft rot Erwini ae from genes to genomes J Molecular Plant Patholo gy 2003 4 1 17 30 5 Gardan L Gouy C Christen R et al Elevation of three subspecies of Pectobacteriumcarotovorum to species lev el Pectobacteriumatrosepticum sp nov Pectobacteri umbetavasculorumsp nov andPectobacteriumwasabiae sp nov J International Journal of Systematic and Evo lutionary Microbiology 2003 53 Pt 2 381 391 6 Gallois A Samson R Ageron E et al Erwiniacarotovo ra subsp odorifera subsp nov associated with odorous 61 2017年 第7期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 7 上接第57页 要害虫可以优先选择使用澳宝丽 此 外 本研究发现3种生物食诱剂还可诱杀小地老 虎 甘蓝夜蛾 银纹夜蛾 小青花金龟等多种害虫 对蔬菜害虫具有一定的广谱性 同时也发现 生物 食诱剂与黄板的组合对田间瓢虫 草蛉 寄生蜂等 天敌昆虫有一定的诱杀作用 建议田间应用时避免 与天敌同时使用 参考文献 1 孔德生 孙明海 惠祥海 等 生物食诱剂与灭多威混用 诱杀花生田 玉米田主要害虫的效果测定 J 中国植 保导刊 2016 36 3 38 41 2 孔德生 孙明海 赵艳丽 等 性诱剂和生物食诱剂对花 生田棉铃虫的防控效果及效益分析 J 山东农业科 学 2016 48 4 102 105 soft rot of chicory Cichoriumintybus L J Internation al Journal of Ssystematic Bacteriology 1992 42 4 582 588 7 Duarte V De Boer S H Ward L J et al Characteriza tion of atypical Erwiniacarotovora strains causing blackleg of potato in Brazil J Journal of Applied Microbiology 2004 96 3 535 545 8 Choi O Kim J Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense causing soft rot on paprika in Korea J Jour nal of Phytopathology 2013 161 2 125 127 9 Marquez Villavicencio M P Groves L R Charkowski O A Soft rot disease severity is affected by potato physiolo gy and Pectobacterium taxa J Plant Disease 2011 95 232 241 10 Onkendi E M Maluleke L N Moleleki L N First re port of Pectobacteriumcarotovorum subsp brasiliense causing soft rot and blackleg of potatoes in Kenya J Plant Disease 2014 98 5 684 685 11 Panda P Fiers M A W J Armstrong K et al First re port of blackleg and soft rot of potato caused by Pecto bacteriumcarotovorumsubsp brasiliensisinNew Zealand J New Disease Reports 2012 26 15 12 Werra P D Bussereau F Keiser A et al First report of potato blackleg caused by Pectobacteriumcarotovorum subsp brasiliense in Switzerland J Plant Disease 2015 99 4 551 13 van der Merwe J J Coutinho T A Korsten L et al Pectobacteriumcarotovorum subsp brasiliensis causing blackleg on potatoes in South Africa J European Jour nal Of Plant Pathology 2010 126 2 175 185 14 Nabhan S Boer S H D 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