大鼠胚胎发育后期胰腺中Mesothelin的表达.doc

大鼠胚胎发育后期胰腺中Mesothelin的表达【关键词】 胰岛?研究原著?Expression of Mesothelin during later rat pancreatic developmentTENG LiPing, HU JingJing, YUAN QingXin, YUAN Li, ZHOU JinYong, GUO Jing, CHENG Mei, LIU Chao, DE Wei1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Nanjing Medical University, 2Department of Endocrinology, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China【Abstract】 AIM: To investigate the molecular mechanism involved in the islet formation and maturation of metabolic regulation by cells. METHODS: The expression patterns of pancreas at embryonic day 15.5 (E15.5) and E18.5 were compared using the GeneChip Rat Expression Set 230 A. Based on the expression profiles of genes, the expression of mesothelin at different stages of rat pancreatic development was detected by RTPCR. RESULTS: Out of 1 319 genes of different expressions, the transcription factors and signal components related to cell differentiation were downregulated at the mRNA level while the genes related to islet formation and the function of metabolic regulation were upregulated. Mesothelin was specifically expressed at E18.5 pancreas, which was confirmed by RTPCR. CONCLUSION: It is from E15.5 to E18.5 that the islet is gradually formed and undergoes further remodeling and maturation. Mesothelin may be a novel regulator of the islet formation and maturation.【Keywords】 mesothelin；islet；RTPCR；GeneChip【摘要】 目的: 探讨大鼠胰腺胚胎发育后期胰岛形成及细胞功能完善相关的基因表达调控. 方法:采用高密度寡核苷酸芯片（Affymetrix芯片）对孕15.5（E15.5）和E18.5胰腺进行基因转录水平分析并用RTPCR验证基因在大鼠胰腺E12.5,E15.5,E18.5,初生和成年这五个不同发育时期的表达情况. 结果:在差异或特异表达的基因中与胰腺细胞分化相关的转录因子和信号分子表达均下调，而与胰岛结构形成及细胞代谢功能完善相关的基因表达上调，其中细胞黏附分子Mesothelin是在E18.5特异表达的基因，RTPCR亦显示Mesothelin在大鼠胰腺胚胎发育后期特异性高表达. 结论: Mesothelin可能对胰岛结构的形成和功能的完善及维持有重要作用.【关键词】 mesothelin；胰岛；RTPCR；高密度寡核苷酸芯片0引言基因调控网络的观点1为胰腺胚胎发育的研究增添了新的亮点. 2004年Melto等以基因芯片技术建立了胰岛分化相关转录因子的表达调控网络2，然而对胚胎发育后期胰岛细胞迁移聚集形成胰岛相关机制的研究还比较局限，对内外分泌细胞功能完善的调节机制亦知之甚少3. Mesothelin，40 ku的细胞表面糖蛋白，主要表达于间皮瘤、卵巢癌以及胰腺癌等恶性肿瘤细胞表面，而在正常组织中主要表达于心脏和肺组织中且表达量较低，但它在成熟胰岛中亦有特异性表达2. 它依靠糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol, GPI）模序附着在细胞表面，而具有这种模序的糖蛋白对细胞间的信号识别以及相互黏附有一定的作用,目前Mesothelin在胰腺胚胎发育中的表达情况及相关功能尚未见阐述. 我们运用高通量的基因芯片技术研究大鼠胚胎胰腺发育后期与胰岛形成及细胞功能完善相关基因的表达，发现在E18.5细胞黏附分子Mesothelin特异性表达，为此我们进一步用RTPCR的方法分别对E12.5,E15.5,E18.5,初生和成年的大鼠胰腺中Mesothelin的表达情况进行研究，旨在了解Mesothelin在不同发育时期的表达差异，从而为研究Mesothelin对胰岛形成和细胞功能完善的作用提供线索.1材料和方法1.1材料成年SD大鼠45只，雌15只，雄30只,体质量250 g左右，由南京医科大学动物中心提供. 于18:00时，将雌雄以12合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5 d（E0.5），取E12.5,E15.5和E18.5胚胎胰腺以及新生鼠胰腺；GeneChip Murine Genome RAE230A芯片（Affymetrix公司）. Eppendorf公司mastercycler PCR仪，Motic显微解剖镜，Affymetrix Fluidics Station 400, Affymetrix Hybridization Oven 640, Affymetrix G2500AGeneArray Scann. Affymetrix Microarray Suite Version 5.0, Affymetrix MicroDB Version 2.0, Affymetrix Data Mining Tool Version 2.0. Trizol Reagent(美国Gibco公司),RNAeasy Mini Kit（Qiagen）,RTPCR试剂盒（Tayobo）.1.2方法取E12.5,E15.5和E18.5母鼠,引颈处死,分离出胚胎,显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后,迅速在液氮中冷冻. 新生和成年鼠直接分离出胰腺4. 用Trizol Reagent提取大鼠E12.5,E15.5，E18.5，新生和成年胰腺总RNA，利用RNAeasy Mini Kit纯化总RNA. 寡核苷酸芯片分析mRNA表达:分别以15 g E15.5和E18.5胰腺总RNA为模板合成双链cDNA，采用BioArrayTM High YieldTM RNA Transcript Labeling Kit体外转录生成生物素标记的cRNA；再经纯化和片段化处理后，取30 g cRNA与GeneChip Murine Genome RAE230A芯片杂交；洗脱后，用链酶亲和素藻红蛋白进行染色扫描检测信号；对获得的信号在微阵列分析软件（the Microarray Suite Software version 5.0）上进行数据分析并对样品的表达结果采用线性度量(scaling)的方法在样品间进行校准. 取1 g的E12.5,E15.5,E18.5，新生和成年五个时期（每组5只）胰腺组织总RNA进行反转录:30 10 min,42 20 min,99 5 min,4 5 min,合成cDNA. PCR扩增：Mesothelin上游引物：5AGGGTTTGCTGGTAGTGT3,下游引物:5TGCTCGTAGGTAAAGGGA3；预计扩增产物298 bp. 引物由江苏百龙基因有限公司合成. Mesothelin的PCR条件:94 2min；98 10 s,50.7 2 s,74 10 s,30个循环；74 5 min.2结果2.1与细胞迁移、聚集黏附相关的基因表达在胰岛结构形成过程中MMPS(matrix metalloproteinases)和它的抑制因子TIMPS(tissue inhibitor of metalloproteinases)介导了细胞的迁移，而Cadherins 对随后的聚集黏附构建成典型胰岛结构起着重要的作用. 这些基因和其他一些与细胞迁移和细胞间支持黏附相关的因子在芯片中有表达且大多呈现为上调的趋势（Tab 1）.表1与细胞迁移、聚集黏附相关的基因表达谱（略）2.2成熟胰岛特异性基因及相关转录因子的表达胰岛成熟尤其是细胞功能完善则能够发挥生物学功能，主要表现在细胞能够完成高葡萄糖刺激后胰岛素分泌（glucosestimulated insulin secretion, GSIS）5这一生理反应. 这个反应通路中涉及到的基因Glut2,pklr和aldolaseB6-8在芯片中表达上调，但其中最为关键的GCK却始终未见表达；调控这个通路的相关转录因子PDX1, HNF1a,HNF4a和HNF6a6-8等表达情况如Tab 2所示.表2成熟细胞特异性基因及相关转录因子的表达谱（略）2.3RTPCR基因芯片的结果显示,细胞黏附分子Mesothelin在E15.5大鼠胰腺中无表达，而在E18.5有表达（Tab 1），可见它是一个特异性表达的基因. RTPCR的结果显示Mesothelin在大鼠胰腺胚胎发育过程中的时空表达差异(Fig 1)：E12.5和E15.5 Mesothelin几乎未见表达，E18.5明显有表达，新生胰腺中亦见表达，成年胰腺中表达较低.3讨论E15.5和E18.5两张基因芯片描绘了大鼠胰腺胚胎发育后期的基因表达谱，从中我们发现与细胞分化密切相关的一些转录因子如ISL1,NKX6.1普遍表达下调，而与胰腺内外分泌功能相关的一些基因却表达上调（结果未显示），尤其是成熟细胞特异性表达的基因以及它们的调控因子表达均上调（Tab 2）. 可见这个时期GSIS通路正在迅速形成，细胞功能正趋于完善，但由于作为成熟细胞中葡萄糖感受器的GCK未见表达，致使GSIS这一通路受阻，胰岛素无法正常分泌，因此这个时期细胞尚不具备成熟的功能，而这可能与典型胰岛结构尚未完全形成有关. E15.5,E18.5这个时期内分泌细胞正积极地组建典型的胰岛结构，与胰岛细胞迁移和聚集黏附相关的因子应该处于相对活跃的状态9. 一些具有细胞支持和黏附功能的基因如Integrins, Embigin和Mesothelin在基因芯片中表达上调，提示它们可能对胰岛细胞的迁移和聚集有一定的作用，从而对细胞的功能完善起到积极的作用.基因芯片中细胞黏附分子Mesothelin在E18.5特异性表达，RTPCR结果显示了Mesothelin在大鼠胰腺胚胎发育中的时空表达差异. 既然它在成熟期是定位在胰岛中，而在胚胎发育早期未见表达，E15.5亦未见表达，直到E18.5开始有表达，那么就预示着它的启动可能与这个时期胰岛的形态学变化有一定的关系. 既然它能够介导肿瘤细胞的迁移和黏附10，那它有可能直接作用于胰岛细胞促进其相互聚集，也可能通过其他信号分子对细胞的功能完善发挥间接的作用. 而这些正是我们下一步研究的内容，相信明确其功能以及搞清其相关调控机制可能会有积极的意义.【参考文献】1 Davidson EH, McClay DR, Hood L. Regulatory gene networks and the properties of the developmental processJ. PNAS, 2003;100: 1475-1480.2 Gu GQ, Wells JM, Dombkowski D, et al. Global expression analysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic developmentJ. Development, 2004; 131: 165-179.3 Perez SE, Cano DA, DaoPick T, et al. Matrix metalloproteinases 2 and 9 are dispensable for pancreatic islet formation and function in vivoJ. Diabetes, 2005;54(3):694-701.4 倪雪峰，袁栎，程志祥,等. 巢蛋白在大鼠胚胎、新生及成年胰腺中的表达变化J. 第四军医大学学报，2004;25(3):193-196.Ni XF, Yuan L, Cheng ZX, et al. Expression and location of nestin in pancreas of E18.5, newborn and adult ratsJ. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(3):193-196.5 Wilding L, Gannon M. The role of pdx1 and HNF6 in proliferation and differentiation of endocrine precursorsJ. Diabetes Metab Res, 2004; 20: 114-123.6 Odom DT, Zizlsperger N, Gordon DB, et al. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factorsJ. Science, 2004; 303(5662): 1378-1381.7 Ashizawa S, Brunicardi FC, Wang XP. PDX1 and