2013-2分子生物学实验.doc

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达1. 构建重组质粒（ pET-28-GFP）： 以特定的引物和模板，利用PCR获得gfP的片段 BamH.Nde酶切 回收 酶切片段 用同样的酶切DH5（pET-28）获得载体片段 连接酶切后回收的gfP片段和载体片段 获得重组质粒。2. 导入与表达：重组质粒 转化DH5 酶切和PCR鉴定 电泳检测 质粒（pET-28-GFP）转化BL-21（pET-28-GFP） 诱导表达与检测 获得绿色荧光蛋白。1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（转化DH5）大肠杆菌感受态细胞的制备1.接种：挑一大肠杆菌单菌DH5（或BL21）落放入5mL LB液体培养基，37 培养过夜。2.转接活化大肠杆菌：取3mL新鲜的LB液体培养基加入50-150L的过夜菌，培养2-3个小时，用处于对数生长期的菌液制备感受态细胞，此时OD600=0.2-0.4。(全班一起可以用锥形瓶活化培养后分装)3.将活化的DH5（或BL21）培养液在无菌条件下收集在一个5mL于eppendorf管中,冰上放置10 min,然后于4 下 6000 rpm 离心5min；4.在无菌条件下弃去上清, 转入到一个1.5mL eppendorf管中。用0.1 mol/L 的预冷的CaCl2溶液1mL轻轻悬浮细胞,冰上放置10 min, 4下6000 rpm 离心5 min；5.加入100L预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液缓和菌液，放置冰上。即成感受态细胞悬液（可-80 长期保存）。转化pET-28-GFP 的连接产物（或者质粒）1.取2个无菌离心管，分别加入100L DH5感受态细胞悬液，第1管加1L无菌水（空白对照），第2管加入质粒DNA溶液1L,轻轻摇匀,冰上放置30 min。2.42 水浴中热激90 s,热激后迅速置于冰上冷却2min。 3.分别向管中加入300L LB液体培养基,混匀后在37 100 r/min振荡培养45min。 4.从管1中取200L涂布于含抗生素的平板上(空白对照),从管2中取200L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 培养20小时。准备：无菌的eppendorf管，枪头，平板，培养基（倒平板时加抗生素kana），涂布棒2 挑平板培养，kana抗性用5mL 玻璃管培养 DH5培养液准备灭菌好的LB培养基（挑平板时要加抗生素Kana）5ml加15L 10mg/mL的卡那霉素（简称kana），那么终浓度（即工作浓度是30g/mL）3质粒DNA的提取分离与纯化 (碱法提取质粒)1将5mL DH5培养液倒入 5mL的 eppendorf 管中, 9000 rpm离心5min。2.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3.菌体沉淀重悬浮于150L预冷溶液中(需剧烈振荡混合均匀),冰浴放置3 min。 4.加入新配制的溶液300L, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3 min。 5.加入250L预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中3 min,12000 rpm离心5min。 6.取上清液500L移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1) 500L,缓和15 s, 12000 rpm离心5 min。 7.将水相移入干净eppendorf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于冰上10 min（或者放入冰箱冷冻层），然后12000 rpm离心10 min。 8 .弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入500 L 70乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，10000 rpm离心2 min。 9.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥得质粒。加灭菌水20L溶解质粒备用。4质粒的限制性内切酶反应分析（酶切）1.按下表加入其混合液反应物（L）pET-28-GFP 质粒 Xho I XbaI10buffer ddH2O5 0.3 0.313.42.离心5 s，混匀。3.37 水浴酶切3-4 h。4.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶15mL。5. 适当放置冷却，45 左右，加入2.5微升的Gelview核酸染料，混匀，倒于电泳胶板上，插好梳子。6.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。7.酶切样品中加入1L溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。8.1TAE Buffer，80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。9.荧光激发器观察质粒DNA条带(核酸染料gelview染色)的酶切情况，并照像。5、质粒PCR检测PCR反应体系 反应物（L）DdwP上P下模板4dNTPBufferTaq polymerse14.21 10.5120.32.离心5 s，混匀。3.放置于PCR仪中。设置合适的PCR程序：94 3min94 30s58 30s 30cycles72 45s72 2min104.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶15mL。5.适当放置冷却，45 左右，加入2.5微升的Gelview核酸染料，混匀，倒于电泳胶板上，插好梳子。6.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。7.PCR样品中加入1L溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。8.1TAE Buffer，80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。9.荧光激发器观察质粒DNA条带(核酸染料gelview染色)的PCR情况，并照像。6 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳（DNA、酶切和PCR电泳分析）1%琼脂糖凝胶的配制1.加50 ml 1TAE缓冲液于三角瓶中，2.精确称取0.4 g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，3.冷却至60 左右，4.轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，5.将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1 mm，轻轻拔除梳子，6.取5l质粒DNA及1L GeneFinder混匀上样7.50-100v约电泳0.5-1小时8.蓝盾可见光透射仪观察结果.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（BL21）BL21 DE3整合以后用于以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。将噬菌体的一部分区域整合与BL21的染色体上1.取2个无菌离心管，分别加入100L BL21感受态细胞悬液，第1管加1 L无菌水，第2管加入质粒DNA溶液1L,轻轻摇匀,冰上放置30 min。2.42 水浴中热激70 s,热激后迅速置于冰上冷却2min。 3.分别向管中加入300L LB液体培养基,混匀后在37 100 r/min振荡培养1 h。 4.从管1中取100L涂布于含抗生素的平板上,从管2中取100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 培养20小时。8 GFP蛋白的诱导表达1.取1支无菌带盖试管，加入新鲜LB液体培养基5mL,加Kan+15L。用枪头在无菌条件下取适量菌垂直丢入试管中，37 培养20小时。2.取1支无菌带盖试管, 加入新鲜LB液体培养基4mL （含有Kan+），加入80L菌液（1:50），37 培养至生长期,约2-3小时。3.加入IPTG（1：1000）至终浓度1mmol/L即4L，