miRNA介绍.doc

miRNA介绍miRNA概述 miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。miRNAs是一种2125nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5端的磷酸基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的特征是其5端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA，需要符合以下条件：a）表达需要用Northern-blot来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a（表达）和b（结构）两条标准；或者a（表达）和c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a（表达）和前体RNA分子结构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。miRNA的生成及作用机制与小分子siRNAs相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些，首先pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存在差别，成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。而在siRNA通路中，单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA，而siRNA也可以阻遏3UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。一般来说，一种miRNA它在mRNA上的识别位点有多个，而这种多个识别位点对于miRNA发挥其转录后抑制作用是必要的。3非编码区也是调控翻译的一个重要组成部分。一个转录本的总体结构由5非编码区(5Untranslated Region，5UTR)，编码区（Open Reading Frame，ORF）和3非编码区（3 Untranslated Region，3UTR）组成。现已了解3UTR具转录本特异性，它在mRNA转录后修饰、细胞内定位及转运、维持mRNA稳定性及保证翻译的效率方面都具重要的调控功能。3UTR是发生3末端加工的区域，包含各种顺式(cis-)作用元件，能够和特定的加工复合物互作以调控mRNA的3末端加工。对哺乳动物的研究表明，真核生物中3末端加工涉及3UTR内某个位点的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾Poly(A+)两个关键过程。应用缺失实验和序列分析已确认了哺乳动物mRNA的3UTR包含了核心顺式作用元件。这类元件与加工复合物的相互作用是3末端形成的核心机制，包括三部分：Poly(A+)位点，也可称为剪切位点(cleavage site， CS)，保守序列为YA (Y代表T 或C)的二聚核苷酸，这种保守序列的单碱基比例为A T C G；Poly（A+）位点上游（5端）10-30 nt 处存在着保守的Poly(A+)定位信号序列(以AATAAA为主)。Poly（A+）位点下游（3端）存在着稳定3末端加工复合物作用的保守性稍差的T/GT丰富序列，称为下游作用元件。miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。对于miRNAs的研究已经成为目前的一大热点，而种种迹象表明miRNAs可能是一类与肿瘤发生有关的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a与CLL有关，miRNA-142则与侵袭性的B细胞性白血病有关。研究发现，一些miRNAs能够在肿瘤形成中发挥作用，可以作为肿瘤抑制基因；另外一些miRNAs则是作为癌基因存在。植物miRNA从2002年起才有报道，编码植物miRNAs的基因明显不同于其他生物：植物编码miRNA基因的转录产物可能更大，植物的miRNA与互补结构的错配一般也少于动物，在进化上表现地更为保守。但和动物miRNA一样，miRNA的转录产物也是发夹状结构，在RNase酶切割后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。科学家们已发现miRNA在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发生，动物胚胎及组织发育等。例如，在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育过程。Brennecke等人利用电脑寻找