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第二章土壤微生物学 第一节 土壤是微生物的大本营 土壤圈是地球系统的组成部分 它处于大气圈 岩石圈 水圈和生物圈的界面 同其它生物圈交互作用 是具有生命活动的体系和微生物生活的良好环境 微生物既是土壤形成过程的作用者 又是土壤的重要组成部分 土壤中微生物种类繁多 数量巨大 这是其他它任何生态系统不可相比的 为什么土壤中存在如此众多的微生物 1 土壤为微生物提供了良好C N营养 微生物生长需要最多的就是C 其次是N植物的根系分泌物30 40 的光合产物以分泌物的形式释放到土壤脱落的根毛 表皮组织植物的枯枝落叶植物死亡后的残体农业生产中 施肥 2 土壤为微生物提供无机盐 微量元素 土壤本身含有各种无机盐 微量元素农业生产中的施肥 P K肥等 微肥等 土壤具有保水性 而且微生物比植物对水分的要求低 植物能生长的土壤 其水分肯定能满足微生物的要求 3 土壤满足了微生物对水分的要求 4 土壤p 值范围5 5 8 5之间 能满足大多数微生物的要求 而且微生物的适应性广 5 土壤中温度变化小 昼夜 季节性变化小 相对于大气 水体而言 6 土壤是不均匀介质 土壤颗粒空隙间充满着空气 好气微生物 颗粒内部厌氧 厌氧微生物 8 土壤能保护微生物不受烈日的曝晒 从而可使微生物免受各种射线的伤害 7 适宜的渗透压 第二节土壤中微生物的分布 一 微生物的分布1 土壤的剖面结构与微生物的垂直分布土壤剖面可以划分为O层 A层 B层和C层 O层为有机质层 耕作土壤没有明显O层 除非在秸秆盖田的情况下 许多森林土壤中O层即为枯枝落叶层 A层为淋溶层 它是土表以矿物质为主的一个层次 降水和灌溉造成强烈淋溶作用 B层为淀积层 由上面层次淋洗下来的物质在此大量沉积 A层和B层加在一起称为土体层C层可能有钙 镁碳酸盐的累积 最下面为R层 即疏松母质层或基岩 因土壤类型不同 层次结构及各层厚度可以有很大差异 表层土中 20 30cm 含量最高 越往下 总的微生物数量越少 但厌氧微生物数量下层土壤中多地表土受阳光直接照射 其中微生物含量较低 但藻类在表层 采取土样时一般要刮开表土2 3cm后采样 2 植物根际土壤与微生物分布植物根际土壤的微生物数量高于根外土壤根际土壤 离根5mm以内的土壤rhizospheresoil根际微生物 rhizobacteria根 土比 R S 根际微生物数量和根外微生物数量之比通常为几到几十为什么 根际微生物 从根冠到成熟区根际微生物的数量快速增加 需要碳水化合物 有机酸和糖类较多的微生物大多繁殖于禾本科植物的根区 而要求氨基酸较多的微生物则繁殖于豆科植物的根区根际微生物特点 数量多于根外土壤 但多样性小于根外土壤 根表的微生物分布是不均匀的 微菌落形式存在 根尖数量少 很多存在于根的裂隙中 3 根表的微生物分布 ScanningelectronmicrographofamicrocolonyofPseudomonasfluorescensstrainWCS365ontomatoroot ConfocalscanningmicroscopyanalysisoftomatorootcolonizationbyP fluorescensWCS365expressingautofluorescentproteins AmixtureoftwoWCS365derivativesexpressingeithercyanfluorescentprotein redcells oryellowfluorescentprotein greencells isshown theoverlapoftheredandgreencoloursresultsinyellow AmixtureofthreeWCS365derivatives 主要存在于裂隙 3 土壤团聚体与微生物的分布 土壤包含矿物质 有机质和各种生物 它们相互结合和作用使土壤具有结构性 特别是土壤团聚体 团粒 它是土壤肥沃的重要因素土壤矿物质颗粒按大小分为砂粒 粉粒和粘粒 粘粒是直径小0 2um的矿质颗粒 大的矿质颗粒为粉粒和砂粒 粘粒的理化性质最活泼 同微生物的关系也最密切 土壤中粘粒的某些特性 团聚体的微孔与结构 土壤团聚体之间和内部的气体与水分状况的差别也很大 而且是处于变动状态 土壤空隙可以完全充满水分或气体 或两者兼而有之 影响微生物不同类群活跃程度 由于土壤的结构性 即使在通气较好的表土层中也存在缺氧部位 土壤团聚体内外CO2 O2浓度差别很大 土壤气体中CO2的浓度一般比大气中含量高1 3个数量级 CO2和O2的浓度的变化受气体扩散和微生物呼吸作用的影响 当土壤缺氧时 不但CO2浓度增高 而且N2O N2 CH4和H2S等还原性气体含量也增加 土壤团聚体内外氧气的分布 a 图示一个耕地粉砂壤土团聚体氧气浓度随距表面距离的延伸而迅速降低 至中央部位为一厌氧带 b 等氧压线图示耕地土壤的一个团聚体 在近中心部位为一厌氧带 由此向外氧气浓度逐渐升高 数字示O2 团聚体表面的主要是好氧的微生物 而且微生物之间竞争较激烈 数量和组成常有变化 生活在团聚体内部的微生物主要是厌氧的微生物 而且数量和组成相当稳定 以微菌落形式存在 二 土壤的异质性与微生物分布的不均匀性和动态变化 由矿物质 有机质和微生物等固相及气相和液相组成的土壤 是地球上异质性极明显的自然体 不但具有层次性差异和复杂的内部结构 即使在同一层次的不同团聚休内外微生物的分布也有很大差异 造成微生物在土壤中分布的不均匀性 耕作影响下土壤的异质性尤为显著 施入的有机和无机肥料即使充分耕翻也不可能是均匀地分布在土层的各个部位 灌溉和施用农药等农业技术措施也加剧了土壤的异质性 所以 取土壤样品是非常关键的 多点取样 三 土壤微生物的季节性变化 春末微生物数量开始上升 到夏季达到最高 到秋天开始又下降 冬季的微生物数量最少 原因 一是温度 微生物的生长需要合适的温度 低温不利于微生物生长繁殖二是营养 春末开始 植物开始生长 到了夏季 各种植物生长最为旺盛 根的分泌物增多 促进微生物的生长 第三节土壤中微生物的数量及其活性 微生物数量决定于土壤的特性 各种土壤都有一定的载菌量和菌容量 它决定于土壤环境的理化因素微生物数量的增减受各种外界因素的影响 营养 当大量营养物质 如新鲜有机质 进入土壤时 异养型微生物的数量急剧增加 但养料消耗后数量会下降 土壤中某种微生物可以在数量上占优势或暂时具有较多数量 但不可能持续 土壤温度 微生物之间是相互制约的当某一类群微生物数量剧增时 其它类群微生物的发展可能受到限制 甚至数量减少 微生物数量可以用细胞数量来表示 也可以用生物量来表示 一 土壤微生物的数量 细菌 bacteria 107 9 g土放线菌 actinomyces 106 7 g土真菌 fungi 103 4 g土藻类 algae 万个 克土原生动物 protozoon 万个 克土数量 细菌 放线菌 真菌 藻类 原生动物若按生物量计算则真菌的生物量最大 上述微生物数量是可培养微生物的数量土壤中的微生物绝大多数是不可培养的 95 不可培养微生物 unculturedmicroorganisms 土壤中微生物的含量与土壤性状直接相关 有机质含量高的土壤 微生物数量高 反之则少 中性土壤 微生物数量多酸性土壤 碱性土壤 微生物数量少干旱土壤微生物数量少耕作土壤比撂荒土壤中微生物数量多 为什么 不同类型土壤中微生物的数量 不同土壤类型 肥力水平 土壤微生物的数量和分布有很大差异 一般来说 我国不同土壤微生物总数 呈如下变化趋势 黑钙土 棕壤 灰壤 水稻土 砖红壤 二 微生物个体数量的测定 1 平板培养计数法制备土壤悬液 进行系列稀释后 涂布在合适的培养基上培养 2 最大或然数 mostprobablenumber MPN 计数 稀释培养计数 适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势 但却具有特殊生理功能的类群 其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰 并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度 如氨化菌 硝化菌 纤维素分解菌 硫化和反硫化细菌等 测定原理和步骤 原理 MPN计数是将待测样品作一系列稀释 一直稀释到稀释液中没有或极少几个 根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度 采用 最大或然数 理论 计算出样品单位体积中细菌数 步骤 菌液经多次10倍稀释后 一定量菌液中细菌可以极少或无菌 然后每个稀释度取3 5次重复接种于适宜的液体培养基中 培养后 将有菌液生长的最后3个稀释度 即临界级数 中出现细菌生长的管数作为数量指标 由最大或然数表上查出近似值 再乘以数量指标第一位数的稀释倍数 即为原菌液中的含菌数 如某一细菌在稀释法中的生长情况如下 稀释度10 310 410 510 610 710 8重复数555555出现生长的管数555410根据以上结果 在接种10 3 10 5的试管中 5个重复都有生长 在接种10 6稀释液的试管中有4个重复生长 在接种10 7稀释液的试管中有1个重复生长 而10 8稀释液的试管中没有生长 由此得出其数量指标为 541 查最大或然数表得近似值17 然后乘以第一位数的稀释倍数 10 5的稀释倍数为105 1ml原菌液中的活菌数 17 105 基于培养的计数法的缺点 第一 没有一种培养基和培养条件能够把土壤中多种多样的微生物都同时培养出来 而分类培养是很繁琐的 何况90 以上的土壤微生物尚不知道如何培养 如用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤细菌的总数并不很适合 因为土壤中的微生物大多是贫营养的 温度的影响一般实验室在分离 培养土壤细菌时通常只是在28 30 下培养 但土壤中存在高温型细菌和低温细菌 但都被忽视了 其实在寒温带和温带地区土壤中也存在低温型甚至嗜冷细菌 pH的影响一般细菌培养基的pH为7 0左右 显然细菌中存在着嗜酸或嗜碱的种群 日本学者从日本土壤中分离到许多生长于pH10和和0 下的细菌 从约1000个土样分离的菌株中经纯化后有83株于0 下在含1 Na2CO3的固体培养基上生长 其中仅50株能在液体培养基中生长 在加拿大土壤中也于低温条件下分离别油菜促生细菌 华中农业大学研究者在28 和10 下分离到的小麦根圈细菌的类型有差别 第二 不可能在制备土壤悬液时把土壤中的微生物都清洗下来 所以获得的结果大大低于实际数量 第三 能够洗脱出来的微生物也不是所有细胞都能在培养基上生长和繁殖 有些细胞可以转变为不可培养的状态 第四 微生物的个体数量对于细菌而言 一个细胞就是一个独立个体 而对丝状微生物如霉菌来说 测定结果就难以说明问题 因为一条长菌丝可以形成一个菌落 它断裂为一些片段后可以分别形成许多菌落 使不同样本之间缺乏可比性 3 显微境下直接测数法 快速粗放不能区分活细胞和死细胞或者微小土壤颗粒 超微细菌和粘粒即使在电镜下也难以区别 所以细胞总数的测定是很粗放的 3 荧光定量PCR技术 提取土壤的总DNA测定细菌的16SrRNA基因拷贝数测定真菌的18SrRNA基因拷贝数结果表示 16S 18S rRNA基因拷贝数 g土壤误差来自 DNA的提取效率PCR扩增 三 微生物生物量测定的原理 微生物生物量即微生物生物物质 microbialbiomass 它是指微生物活体的总量间接测定 生物量 细胞数 体积 比重 直接测定 直接测定微生物生物量比测定个体数量更能反映微生物在土壤中的实际含量和作用潜力 一 生物量测定的生理学方法 生理学方法是根据微生物的代谢活性来测定生物量 目前使用比较广泛的是英国学者詹金森 Jenkinson 等提出的土壤熏蒸法 微生物碳的测定 原理和主要步骤 先将氯仿 CHCl3 放入盛有土样的容器中 密闭容器 使其散发为气态 渗入土壤样本以杀死所有微生物 再开启容器或用气体置换法使土样中残余气态氯仿全部散发 然后以少量同一土样接种 置温室中培养 最后测定经氯仿熏蒸杀死的土样中的微生物残体被重新接种的微生物分解矿质化后所释放出来的CO2量 同时用待测土样作对照 除不加氯仿处理外 其余步骤完全一样 通过比较氯仿熏蒸后土壤和未经氯仿熏蒸的土壤中释放的CO2量的差异来计算生物量 在计算时要利用一个转换系数 一般是0 4 0 5 因为细菌矿化率约为33 真菌约为44 假定土壤中细菌和真菌生物量之比为1 3 所以平均矿化率为41 二 生物量测定的生物化学方法 生化测定方法的原理是分析各类微生物细胞中都具备且含量较接近 但不在土壤中游离存在的生化成分 以此来计算微生物生物量 较常测定的成分有DNA ATP 细胞壁成分和光合微生物色素等 1 土壤DNA的测定DNA在微生物细胞中的含量较恒定2 ATP含量测定由于细胞死亡后ATP迅速消失 所以能够根据测定的土壤中ATP的浓度来计算生物量 测定方法 荧光比色法 高压液相色谱关键 必须迅速破碎细胞并钝化ATP合成酶和降解酶的活性 从土壤ATP量换算为细胞碳量时一般以120作为系数 水体样本采用的系数为250一286 用ATP来换算生物量不如DNA测定法精确 因为有些微生物在营养和生理条件改变时 ATP含量起变化 所以有人建议通过测定土壤中总腺苷酸库 AT 来计算生物量 其数值不因细胞代谢状况而波动 计算公式是 AT ATP ADP AMP 土壤微生物数量 包括细胞数和生物量 只能在一定程度上比较微生物的作用强度 或者只说明它们的潜在活性 例如 有的孢子和休眠细胞在平板培养测数时可以生长 但并非代谢旺盛的细胞 所以研究工作者有时需要测定土壤中微生物的实际活性 三 土壤中微生物活性的测定 1 放射性同位素法例如 测定光合微生物的光合作用 可以使微生物吸收14CO2 再测定细胞的14C量测定硫酸盐还原作用可以利用35SO42 然后分析H235S 测定土壤微生物呼吸强度可以加入14C标记的有机物质 然后分析14CO2的产生 2 稳定性同位素法 研究中应用最多的是C和S的稳定性同位素 自然界的碳素主要以12C存在 但也有少量13C 硫素主要为32S 也存在34S 应用原理 大多数生化过程优先利用较轻的碳和硫 如在12CO2和13CO2同时存在下 光合微生物细胞碳素富集12C 残留的CO2则富集了13C 根据 重 与 轻 同位素的比例可以测知生物过程和时间性因此稳定性同位素测定法不但可以用于研究土壤中微生物的活性和作用过程及土壤中腐殖质的形成及其寿命 而且能用于地球物质大循环以及土壤圈同其它生态圈的物质交换 3 微生物的呼吸率 向土样中加入基质后在短期内出现的呼吸强度同微生物的活性成比例 这一方法同熏蒸法有较好的相关性而且加用不同的抑菌剂时可以分别测定细菌和真菌的生物量 第三节土壤微生物种群结构 一 土壤细菌 A 单细胞 B 繁殖速度快C 个体微小 um 接近于土壤粘粒的大小D 以杆菌占优势 G 为主E 数量大 细菌占土壤微生物总数的70 90 F 多样性最丰富 营养类型多样性 代谢多样性 遗传多样性G 中性土壤中多耕作土壤中 以每亩20cm深耕作层土壤重30万公斤计 细菌湿重约90 225kg 亩 以土壤有机质含量为2 计算 则所含细菌干重约为土壤有机质的1 左右 Caulobacter 柄杆菌Corynebacterium 棒杆菌属Bdellovibrio 蛭弧菌 土壤放线菌actinomyces 土壤放线菌 是生活于土壤中呈丝状单细胞 革兰氏阳性的原核微生物 在自然界分布很广 绝大多数为腐生 少数寄生 产生种类繁多的抗生素 据估计 已发现的4000多种抗生素中 有2 3是放线菌产生的 如链霉素 庆大霉素 利福霉素等 放线菌 原核生物 多分布在有机物较丰富的碱性土壤中 放线菌的生长使土壤带有特殊的土腥气味 放线菌也是原核微生物 菌丝比真菌细 通过断裂菌丝繁殖或无性孢子繁殖土壤中放线菌数量仅次于细菌105 107 克土壤放线菌占土壤微生物总数的5 30 由于菌体大 其生物量与细菌接近 土壤中主要的放线菌优势属 链霉菌属 streptomyces 诺卡氏菌属 Nocardia 小单孢菌属 Micromonospora 土壤真菌 菌体多呈分枝丝状 少数菌丝不发达或缺乏 具真正细胞核 真核生物 生态习性 适宜酸性 好气性微生物 化能有机营养型作用 是土壤中糖类 纤维类 果胶和木质素等含碳物质分解的积极参与者 菌体粗大 菌丝最长可达40米 其生物量是所有微生物类群中最高的 土壤霉菌为好氧性微生物 一般分布于土壤表层 深层较少发育 以丝状体和孢子体形式存在于土壤中 103 104 克土壤 喜欢酸性土壤 如森林土壤中数量多 真菌属异氧型微生物 土壤真菌的多少与土壤有机质含量密切相关 根据真菌的营养过程将真菌分为三类 寄生真菌 引发植物的病害 腐生真菌 分解有机残体 共生真菌 与植物体共生 也叫菌根菌 土壤中真菌主要类群 青霉 Penicillium 曲霉 Aspergillus 镰刀霉 Fusarium 木霉 Trichoderma 根霉 Rhizopus 毛霉 Mucor 酵母菌 真核生物单细胞 有时候为假菌丝主要存在于果园土壤中 酵母在果园土壤里含量几十万个 g土壤 藻类 植物还是微生物 含叶绿素 能进行光合作用 合成有机质 由于需要光 它们主要生活在土壤表层 地表藻类能够和土壤颗粒粘结在一起 增加土壤表面的强度 可使土壤侵蚀明显减轻 另外蓝绿藻可固定N素 藻类包括单细胞或多细胞的原核或真核生物土壤中的藻类主要是绿藻和硅藻 在土壤微生物总量中不足1 土壤藻类是土壤生物的先行者 可通过光能自养的能力 成为地球上有机物质制造者之一 荒地和沙漠土壤中的腐殖质多来自土壤藻类 根据藻类的生长状况 可判断出土壤的肥力状况和性质 肥沃土壤 藻类生长旺盛 土表常出现黄褐色或黄绿色的薄藻层 硅藻多则是土壤营养丰富的证明 Botrydiopsisarhiza 原生动物 原生动物 万个 克土纤毛虫 鞭毛虫 肉足虫等为主 它们以其它微生物和有机物碎片为食 对其它几类微生物的数量起调节作用 第四节土壤微生物个体生态学与原位研究 群体生态学 synecology 研究由多种生物构成的群落 Community 及与环境的相互关系个体生态学 autecology 研究一种生物 甚至一株植物或一个动物 与环境的相互关系 一 细菌个体生态学研究技术 个体生态学不但要区分土壤中不同的细菌种 而且还要分别研究种内不同类型菌株和个体的动态 但土壤是细菌数量众多的诸种微生物共居的异质体 因此要求采用特异性很高的方法和手段来跟踪研究对象 用特异的DNA或RNA序列作为核酸探针检测引入环境中的目标微生物 探针与从土壤中提取的DNA或RNA杂交 根据杂交信号的有无 强弱分析目标微生物 或者和经过培养后的菌落杂交 可以检测目标微生物的数量 目标微生物的检测方法 1 核酸探针法 用探针和环境中的DNA杂交 菌落原位杂交 colonyinsituhybridization 是将环境中的细菌培养后 再将菌落转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上 然后将膜上的菌落裂解以释放出DNA DNA经烘干固定后与标记的探针杂交 检测杂交信号 2 PCR baseddetectionmethods 常规PCR法的检测是根据所设计的引物对特异性片段进行PCR扩增 通过对产物琼脂糖凝胶电泳 看是否能扩增出特异性条带来检测样品中是否含有目标微生物现已发展了许多衍生技术 如原位PCR 套式PCR 荧光定量PCR以及real timePCR等 3 免疫学方法根据微生物自身的特异性蛋白或外源基因能产生的蛋白 制备相应的抗体 再用相应的抗体去检测 以此同其它微生物相区别 免疫荧光菌落染色 IFCS 和菌落免疫杂交检测 colonyimmunoblotassay 技术既应用了免疫学和杂交技术的选择性 又利用了菌落分离的优点 免疫学或遗传标记探针技术能提供特定细菌的总细胞浓度方面的信息 但并不能展示土壤中特种生物群体的存活力及生理活性 而且技术要求高 费用高 操作复杂 因此 其应用有局限性 4标记基因检测法基因标记是指将外源DNA引入受体菌株 经表达以后 使受体菌株细胞能够在环境中与其他微生物相区别 标记基因分为 选择基因 担负筛选细胞的作用 如抗生素抗性基因报告基因 则是根据表达产物直接显示目标微生物的存在 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶 一 标记基因必须具备的基本条件 1 环境中应很少或没有这种标记系统的存在 因此不产生背景干扰或者干扰很小 2 标记基因能够在宿主细胞中稳定存在 3 标记基因的表达对目标生物的生理 生化性质影响小 4 标记基因的表达能够达到可检测的水平 检测灵敏度高 检测过程方便简单 5 应用于田间实验对环境不产生影响 环境安全 二 标记基因的种类1 抗性标记基因a 抗生素抗性基因 Apr Tcr Cmr Kanr Hygrb 重金属抗性基因 Cur Znr Cdr潮霉素抗性基因Hygr是真核微生物中最常用的是标记基因抗性标记可以通过分子生物学方法获得或者通过传统的突变方法获得 采用抗生素 或重金属 选择性培养基检测目标微生物 四环素抗性基因 Tcr Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上 抑制核糖体的转位过程 四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质 与细菌细胞膜结合 阻止四环素分子进入细菌细胞 氨苄青霉素抗性基因 Apr Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶 催化 内酰胺环的水解 使氨苄青霉素失活 氯霉素抗性基因 Cmr Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上 阻止蛋白质合成 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶 使氯霉素乙酰化 导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上 卡那霉素 Kanr 新霉素 Neor 抗性基因Kanamycin Neomycin均属脱氧链霉氨基葡萄糖苷类抗生素 可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成 Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化 使之不能进入细胞内 抗生素抗性作为检测标记具有简便 快速 费用低 实验结果可以进行统计分析等优点 由于土著微生物中的某些微生物会产生不同程度的天然的抗性 对目标微生物菌数的测定会有影响 如选择两种或两种以上抗生素基因标记 则测定结果非常可靠 为了防止抗生素抗性基因的扩散 生态学研究中通常不采用抗生素抗性基因 即使要用 也尽量不要采用人类疾病治疗常用的抗生素相应的抗性基因 抗生素抗性基因不要标记在质粒上 因为质粒容易扩散 而要标记在染色体上 2 显色基因其表达产物 酶 可催化某些易检测的生化反应 如lacZ GUS 半乳糖苷酶基因lacZ带有lacZ的微生物在含有底物5 溴 4 氯 3 吲哚一半乳糖苷 X Gal 的平板上或溶液中使菌落 菌体 变成蓝色 检测直观 Background activityVisibleonlyinbigamountsofcells colonies 邻苯二酚2 3一双加氧酶基因 xylE XylE催化邻苯二酚产生黄色的产物 使得标记菌的菌落呈现黄色 葡萄糖苷酶基因 gus 该基因编码一种可分解各种 葡萄糖苷衍生物的水解酶 它的适用范围十分广泛 因为许多生物中没有这种基因 gus基因 3 端 与其它结构基因形成融合基因后仍可以正常地表达 所产生的融合蛋白仍然具有GUS活性 在一定条件下与X G1ucuronicacid 5 bromo 4 chloro 3 indolyl D glucuronicacid 底物发生作用 产生蓝色物质 既可以用分光光度计法测定 又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点 当加入4 甲基伞形酮基 葡萄糖酸苷时生成4 甲基伞形酮 发荧光 465nm 因而可以用荧光光谱法测定 由于荧光强度高 本底低 故荧光检测极为灵敏 检测容易 迅速并能定量 价格便宜 未标记菌株形成的根瘤 gus标记菌株形成的根瘤 3 生物发光基因 发光酶是生物体内催化发光反应的一类酶家族萤火虫发光酶Luc 催化ATP至底物萤光素之间能量转移产生光能 但是因其底物昂贵很少应用 细菌发光酶lux 它催化长链脂肪醛和FMNH2 黄素单核苷酸 的氧化产生蓝绿色的光 绝大多数发光细菌是从海洋中分离到的 只有发光致病杆菌 Xenorhabdusluninescens 分离自人体伤口和昆虫病原线虫 尽管 X luninescens 是一种陆栖细菌 但其与线虫共生 迄今尚无采用平板直接分离到作为根圈细菌群落成员的自然生物发光细菌的报道 许多Lux标记菌株的发光水平足以满足在暗室内直接观察平板上生长的发光菌落 Bioluminiscence luxCDABEABcodefortheluciferaseCDEcodeforluciferinbiosynthesis markstrategies IntroducethewholeoperonluxCDABEIntroducetheluciferasegeneluxABLuciferinhastobeexternallyadded 4 发光蛋白质基因发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质 绿色荧光蛋白基因 gfp 红色荧光蛋白基因 rfp 其他 绿色荧光蛋白的发现 基本结构及性质GFP的发现绿色荧光蛋白 greenfluorenscentprotein GFP 最初是从维多利亚多管水母 Aeguoriavictoria 中发现的天然荧光蛋白 aequorin 当结合Ca2 后发出蓝光 紫外光激发GFP产生绿色荧光 GFP基本结构GFP的三维结构是由11股链组成的 一圆柱状结构 圆柱的中心带有一个与其共轴的变形a一螺旋 生色团就位于该a一螺旋中 GFP的氨基酸序列中的65 67位的丝氨酸 脱氢酪氨酸 甘氨酸通过共价键形成独特的 相当稳定的环状三肽结构 构成GFP生色基团的核心 这种坚固的桶状结构可以非常有效地保护生色团 赋予GFP高度的稳定性 使其能够抵抗高温及变性剂 生色团的形成需要分子氧 绿色荧光蛋白的应用优点 GFP构象非常稳定 在细胞中表达的GFP自发环化成熟 保持它的荧光特性 检测方便因为GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子 也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题 只需紫外光或蓝光激发 即可发出绿色荧光 用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到 而且灵敏度高 对于单细胞水平的表达也可识别 荧光稳定GFP对光漂白有较强的耐受性 能耐受长时间的光照 GFP在pH7 12范围内也能正常发光 对高温 70 碱性 除垢剂 盐 有机溶剂和大多数普通酶 链霉蛋白酶Pronase除外 都有较强抗性 无毒害从目前的研究结果来看 GFP对生活的细胞基本无毒害 对目的基因的功能也没有影响 共用性和通用性首先表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制 在微生物 植物 动物中都获得了成功的表达 其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制 在各个部位都可以表达发出荧光 易于构建载体由于GFP分子量较小 仅为27 30kD 编码GFP的基因序列也很短 为2 6kb所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒 而不至于使质粒过大影响转化率 可进行活细胞定时定位观察对活细胞中蛋白的功能研究 更能接近自然真实的状态 通过GFP可实时观察到外界信号刺激下 目的蛋白的变化过程 借助于近来广泛使用的激光扫描共聚焦显微镜 结合强大的计算机软件 可进行三维显示 易于得到突变体GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体 而且增强了荧光强度 适合在不同物种中专性表达 GFP labelledrice blastfungus Leaf b andstem c withconfocalimagesshowingGFP expressingM griseaGuy11inthediseasedareasandalsointhevasculartissueoftheleafandstem Confocalscanninglasermicroscopyanalysisoftomatoroots redbyautofluorescence beingcolonizedbythephytopathogenicfungusFusariumoxysporumf sp radicislycopersicimarkedwithgfp Theimagewastaken3daysaftergerminatedtomatoseedshadbeenplantedinsandcontainingsporesofF oxysporumf sp radicislycopersici Ontheirwaytowardtherootsurface fungalhyphae green hadbeenattachedtoandintermingledwithroothairsinthecrownzone Peroxisomalfattyacidbeta oxidationisnecessaryforplantinfectionbythericeblastfungusMagnaporthe