结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺分子机制研究.pdf

2 0 0 7年第 3 5卷第 1 期P r o g i n Mi c r o b i o l h n m u n o l F e b 2 0 0 7 箜 结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺分子机制研究 5 姜 英 彭俊平 杨 帆 余 黎 王玉琳 金 奇 1兰州生物制品研究所 兰州 7 3 0 0 4 6 2中国疾病预防控制中心病毒基 因工程 国家重点实验 室 北京1 0 0 0 5 2 摘要 吡嗪酰胺 P Z A 是结核病短程化疗中的一线抗结核药物 由吡嗪酰胺酶转换成为活性形式吡嗪酸而生效 吡嗪酰胺酶由p n c A基因编码 p n c A基因突变会导致该酶活性丧失 与 P Z A耐药性产生有关 为了进一步明确 P Z A 耐药性产生的基因学基础和 P Z A耐药株的p n c A基因突变率 对中国 1 0 0株结核分枝杆菌临床分离株进行了 D N A 序列测定 其中 8 5株为 P Z A耐药株 1 5株为 P Z A敏感株 P Z A耐药株有 2 7 2 3 8 5 发生了p n c A基因突变 从而 导致吡嗪酰胺酶基本氨基酸序列的改变 突变分布在 p n c A基因开读框架 1 7 5 4 6 位的核苷酸 其中有一株突变位 于p n c A基因的调节区域 l 1 位处 同时发现2 0 3 1 5 p n e A敏感株也发生了p n c A基因突变 敏感株发生突变可能 是由于P z A敏感性实验不准确或存在其它耐药机制 实验表明 p n c A基因突变是 P Z A耐药的主要机制之一 中国 P Z A耐药临床分离株尚存在其它耐药分子机制 关键词 结核分枝杆菌 吡嗪酰胺 耐药 D N A序列分析 中图分类号 R 3 7 8 9 1 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 5 5 6 7 3 2 0 0 7 0 1 0 0 0 5 0 5 Mo l e c u l a r b a s i s o f My c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s t o p y r a z i p a ml d e r e s i s t a n c e J I A NG Y i n g PE NG J u r t p i n g 2 Y A NG n2 e t a 1 L a a z h o u I n s t t u e o fB d o g c a P r o d u c t s L a n z h o u7 3 0 0 4 6 C h i n a 2 S t a t e k L a b o r a t o r y f o r Mo l e c u l a r V i r o l o g Y a n d G e n e t i c E r n e e r 打 喀 C h i n e s e C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d Pre v e n t o n n g 1 0 0 0 5 2 C h na 1 Ab s t r a c t P y r a z i n a m i d e P Z A i s a n i m p o r t ant c o m p o n e n t i n s h o r t c o u r s e t u b e r c u l o s i s c h e mo t h e r a p y Wh i l e t h e m o d e o f a c t i o n o f P Z A i s n o t f u l l y u n d e rst o o d t h e r e i s s u b s t anti a l e v i d e n c e t h a t t h e d r u g mu s t fi rst b e c o n v e r t e d t o p y r a z i n o i c a c i d P O A b y t h e e n z y m e p y r a z i n a mi d a s e P Z a s e f o r i t s ant i m y e o b a e t e r i al a c t i v i t y T o f u r t h e r d e fi n e the g e n e t i c b a s i s o f P Z A r e s i s t a n c e a n d d e t e r mi n e the f r e q u e n c y o f p n c A mu t a ti o n s i n P Z A r e s i s t a n t s t r a i n s we s e q u e n c e d the p n c A g e n e f r o m a p an e l o f 1 0 0 c l i n i c a l i s o l a t e s i n c l u d i n g 8 5 P Z A r e s i s t a n t s t r a i n s and 1 5 P Z A s u s c e p ti b l e s t r a i n s T h e r e s ult s s h o we d tha t 2 7 2 3 8 5 P Z A r e s i s t a n t i sol a t es h a d p n c A mu ta ti o n s w h i c h a l t e r e d the p ri ma r y a mi n o a c i d s e q u e n c e o f p y r a z i n a m i d ase Mu tati o n a w i t h i n the o p e n r e a d i n g f r a me w e r e d i s t r i b u t e d i n the r e g i o n f r o m n u c l e o ti d e 1 7 t o n u c l e o t i d e 5 46 O n e p u t a ti v e r e g u l a t o r y m u t a ti o n w a s i d e n ti f i e d Me anw h i l e 2 0 3 1 5 P Z A s u s c e p ti b l e i sol a t e s a l s o h a d p n c A g e n e mu ta t i o n s and i t i s n o t c l e a r wh e the r t h i s r e s u l t i s d u e t o i n c o r r e c t P Z A s u s c e p t i b i l i ty t e s t i n g o r an a d d i t i o n al me c h a n i s m o f r e s i s t anc e e x i s ti n g We c o n c l u d e t h a t m u ta ti o n i n p n c A i s a m a j o r m e c h a n i s m i n P Z A r e s i s t a n c e and the o the r m o l e c ular m e c h a n i s m s e x i s t i n P Z A r e s i s t a n t c l i n i c al i s o l a t es i n C h i n a Ke y wo r d s My e o b a e t e r i u m t u b e rculo s i s P y r a z i n a mi d e Dr u g r e s i s t an c e DNA s e q u e n c i n g 吡嗪酰胺 P Z A 是烟酰胺 尼克酰胺 的类似 物 是重要的抗结核一线药物 它能杀死半休眠期 结核分枝杆菌 而其他药物所无法做到 因此可对缩 短结核病化疗期起着极为关键的作用 P Z A的体内 作用机制 尚不十分 明确 它进人体内后可能 由细菌 的吡嗪酰 胺酶 P y r a z i n a mi d a s e P Z a s e 将其 转化成 活性形 式 吡嗪 酸 P y r o z i n o i c a c i d P O A 而发 挥作 用 研究表明 结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药主 要是 由于 编码 P Z a s e的基 因 p n c A发生 突变所致 实验中对临床分离的耐 P Z A结核分枝杆菌的p n c A 收稿 日期 2 0 0 6 0 4 2 1 修 回日期 2 0 0 6 0 8 2 3 作者 简介 姜 英 1 9 7 3 女 硕士 助理研 究员 主要从事分 子生物 学研究和病毒性疫苗研究工作 基因进行 测 序 分 析 旨在研 究 p n c A基 因突 变 与 P z a s e 活性丧失 及 P Z A耐药性之间的关系 以及 了 解国内 p n c A基 因突变的分布 材料和方法 1 菌株 结核分枝杆菌 H 3 7 R v标准株 由北京市结核病 胸部肿瘤研究所提供 1 0 0株结核分枝杆菌临床分 离株为 2 0 0 2年 五省 市结核病院 所 临床分离所 得 其中河南省 2 1 株 广东省 5 株 陕西省 2株 安 徽省 7 O株 北京市 2株 8 5株耐 P Z A株 分别为河 南省 1 1 株 广东省3 株 陕西省2株 安徽省 6 8 株 北京市 1 株 1 5株 P Z A敏感株分 为河南省 1 O株 广东省 2株 安徽省 2株 北京市 1株 细菌培养采 维普资讯 6 2 0 0 7年第 3 5卷第 1 期P r o g i n Mi c r o b i o l I m m u n o l F e b 2 0 0 7 V o 1 3 5 N o 1 用改良罗氏法 按 结核病诊断细菌学检验规程 进 行菌种鉴定为结核分枝杆菌 细菌的药敏试验采用 绝对浓度法 结果判定采用中国安徽省标准 细菌在 高于 5 0 g m l P Z A的培养基 上可 以生长判定 为耐 药 实验采用 了 P Z A的两个药 物浓度 5 0 p g m l Z 5 0 mt 耐药 菌 株分 别 定 为低 耐 药 组 和高 耐 药组 2 方法 2 1 吡嗪酰胺酶 P Z a s e 检测 D u b o s 琼脂培养基高压灭菌后按每管 4 m l 进行 分装 直立放置 从罗 氏培养基上刮取尽可能多的生 长 良好 的细菌 接种于 D u b o s 琼脂平面 2管 3 7 培养 7 d 取 出一管 滴加 1 硫酸亚铁胺 现用现 配 至试管中静置片刻 如靠近琼脂表面 即菌落生 长的地方 出现红色条带 几分钟后条带消失 即 为 P Z a s e阳性 如果无 红色条带 1 4 d后取 出第二 管 如上法进行测定 如仍无红色条带 即为 P Z a s e 阴性 阳性对照采用结核分枝杆菌标准株 H 3 7 R v 阴性对照采用牛分枝杆菌 2 2 D N A提取 在 E p p e n d o ff E P 管中加入 1 T E 1 0 0 1 用 接种环从 罗 氏培养 基斜 面上 刮取适 量细菌 人 E P 管 9 0 灭活 3 0 m i n 加入溶 菌酶至终浓 度 5 ra g I I l l 3 7 C 水浴 1 0 h 间或震荡 加入预热的 1 0 S D S 至终浓度 1 蛋 白酶 K至终浓度 1 m g I I l l 5 6 水 浴过夜 s 一 饱和酚提取两次 氯仿 异丙醇提取 2 次 无水乙醇沉淀 7 0 乙醇洗涤 2 0 C保存备用 2 3 P C R反应 引物自行设计并由北京赛百盛生物工程公司合 成 上游 引物 p n c A 1 5 G C T G G T C A T G 1 T r C G C G A T C G 3 下游引物 p n c A2 5 C G C 1 T r G C G G C G A G C G C T C C A 3 扩增 p n c A全基 因 5 6 1 b p及 上游 1 0 3 b p 下游 6 7 b p共长 7 2 0 b p的 D N A片断 P C R反 应采用 5 O 反应 体系 包括 1 0 P C R b u ff e r 5 l 2 5 m mo l L d N T P 4 1 d 1 5 U T a q酶 1 0 p m o L L引物 模板 D N A1 2 E p p e n d o r f 公司梯度 P C R扩增仪进 行扩增 最 终反 应 参 数 如 下 9 4 预 变性 5 ra i n 9 4 变性 I mi n 6 2 复性 l m i n 7 2 延伸 1 ra i n 3 5 个循环 最后一步 7 2 延伸 l O mi n 取 P C R产物进行琼脂糖 电泳 进行初步定量 2 4 测序 测序采用 Me g a B A C E 4 0 0 0全 自动测 序 系统 A m e r s h a m P h a m a c i a公司测序试剂盒 D Y E n a m i c E T T e r m i n a t o r C y c l e S e q u e n c i n g P r e m i x k i t s U S 8 1 0 5 0 2 5 D N A序列分析 采用软件为 B I O E D I T D N A S T A R 结果 1 P Z a s e 检测结果 对来 自于五省 市的 1 0 0株结核分枝 杆菌临床 分离菌株及标准株 H 3 7 R v进行 了 e Z t e 检 测 共获 得 P Z a s e阳性 4 6株 P Z a s e阴性 5 4株 具 体结果见 表 1 表1 1 0 0株结核分枝杆菌及标准株 l 1 3 7 R v吡嗪酰胺酶检测结果 T a b l e 1 T h e P Z a s e a s s a y o f 1 0 0 c l i n i c a l i s o l a t e s 0 f t u b e r c u l o s is a n d t h e r c f e r e n c s t r a i n H3 7 Rv 2 P Z A敏感性试验结果 P Z A敏感性试验在酸性琼脂培养基上进行 将 受试菌悬液分 别接种 于不 含 P Z A和 5 0 g n a 2 5 0 t w m t A的酸性 p H 5 5 琼脂培养基上 3 7 C培养 维普资讯 2 0 0 7年第 3 5卷第 1 期P r o g i n Mi c r o b i o l I m mu n o l F e b 2 0 0 7 t V o 1 3 5 N o 1 2 4周 判定结果 在本次试验所检测的 1 0 0株结 核分枝杆菌临床分离株 中共获得 P Z A敏感菌 1 5 7 株 低耐药 P Z A为5 0 t m 03 1 株 高耐药 P Z A为 2 5 0 1 L g m 1 5 4株 实验结果见表 2 表2 1 0 0株结核分枝杆菌P Z A敏感性试验结果 T a b l e 2 T h e t e s t e d P Z A s e n s i t i v i t y i n 1 0 0 c l i n i c a l i s o l a t e s o f M t u b e r c u l o s i s 3 结核分枝 杆菌 I临床 分 离株 标 准株 H 3 7 Rv的 p n c A基因突变情况 标准株 H 3 7 R v 未检测到突变 在 1 0 0株临床 分离株中 共检测到 2 6株发生突变 在高耐药的 5 4株菌株中 共有 1 5株发生突变 分别来 源于安徽 A H 7 1 9 陕西 S H A N N I 广东 G D 4 突变形 式包括点突变 A H 7 1 6 G D 4 缺失 A H 1 7 1 8 S H A N N1 和插入 A H1 9 在 3 1株低耐药 菌株中 共有 8株发生突变 分别来源于安徽 A H1 6 和广 东 G D 2 3 突变包括 5例单点突变 A H 1 5 G D 2 2例缺失 A H 6 G D 3 1 5株敏感菌株中 有 3株发生 了突变 2株来 自于河南 1株来 自于广东 编号分别 为 HN 1 HN 2 G D 1 H NI 在核苷酸 3 8 9 位发生 T C的单碱基突变 H N 2在核苷酸 1 7 4位 后插入 T 使 O R F发生改变 导致 5 8位后蛋白质完 全发生改 变 G D 1 在核苷酸 l 7位上发生 T G的单 碱基 突 变 在对结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶检测中 发现 P Z a s e 阳性菌株中 共有 9 株发生突变 其突变形式 包括点突变 缺失 插入 P Z a s e阴性菌株 中 共有 1 7 株发生突变 上述突变形式也均存在 其中 G D 2突 变位于起始密码子上游 一l 1位处 发生了 A C的 单碱基置换 详细情况见表 3 讨论 1 9 5 2年 P Z A的杀菌作用被发现 但直到上世 纪 8 0年代它才与异烟肼 利福平联合运用于治疗肺 结核 P Z A在酸性 p H 5 5 环境中能杀死半休眠期 的结核杆菌 但其作用机制 尚未 十分 明确 研究表 明 P Z A是尼克酰胺类似物 可能由结核杆菌体内的 P Z a s e 将 P Z A转化为活性形式 P O A实现杀菌作用 但 P Z A或 P O A的体内靶标尚未找到 在 P Z A应用 于临床后不久 结核杆 菌对 P Z A 的耐药 性就 出现 了 研究发现 P Z A耐药菌株常常丧失 P Z e 或尼 克酰胺酶 活性 由于 P Z a s e由 p n c A基 因编码 因 此 p n c A基因变异是结核杆菌产生 P Z A耐药性 的一 个重要机制 维普资讯 8 2 0 0 7年第 3 5券第 1 期P r i n Mi c r o b i o l I mm u n o l F e b 2 0 0 7 Vo 1 3 5 N o 1 表 3 1 0 0株 结核分枝杆菌 临床分离株 p n c A基 因突变情况 Ta b l e 3 pn c A mu t a t i o n s i n 1 0 0 c l i n i c a l i s o l a t e s M t u b e r c u l o s i s N o t e P P o s i t i v e N N e g a t i v e R e s i s ta n c e H H i g h r e s i s t a n c e R e s i s t a n c e L L o w r e s i s t a n c e 由于 P Z A在结核病化疗 中的不可替代性 P Z A 药敏试验显得尤为重要 但是 P Z A仅在低 p n 约 p H 5 5 环境中有活性 而如此低的 p H又限制了许 多结核杆菌临床株 的生长 因此难 以在 目前的细菌 培养方法基础上建立可靠 的 P Z A药敏试验 如何 快速 准确地对结核分枝杆菌进行药敏分析 是结核 病控制中的一个令人十分关注的问题 近年来有许 多方法 问世 其 中 D N A序列分析是一种快速 客观 的耐药分析法 其利用基因型与耐药表型之间的联 系来判断结核分枝杆菌对 P Z A的敏感性 常可在 1 维普资讯 2 0 0 7年第3 5卷第 1 期P r o g i n Mi c r o b i o l I m m u n o l e b Q 箜 一 2 d内得到药敏结果 近年来 已有几个 国家报导 了本 国耐 P Z A的结核分 枝杆菌 p n c A基 因突变情 况 1 这次实验共对 1 0 0株临床分离结核分枝杆菌的 p n c A基因进行 了 D N A序列测定 共有 2 6株 2 6 发生突变 其 中 3 1株低耐药菌株 P Z A耐药浓度 5 0 t mD中有 8株 2 5 发生突变 5 4株高耐药 菌株 P Z A耐药浓度 2 5 0 g m 1 中有 1 5株发生 2 8 发生突变 突变类型包括点突变 插人 缺失 导致的蛋 白质改变 形式有 单个 氨基酸 的取代 插 人 缺失 插入终止密码子 整个 O R F改变产生无意 义多肽 突变位点从核苷酸位点 1 7 5 4 6位均有出 现 分布于整个基 因上 无特定规律 可循 这 与国外 报道一致 提示 P Z A a 活性有复杂的影响机制 由于p n c A基因片段不长 p n c A基因上的每个核苷 酸均相对保守 菌株 G D 2 在起始密码子上游 一1 1 位发生 A c的单核苷酸取代 这一位点的突变也 见之于其 他报道 J 提示 出现在 p n c A调节基 因或 p n c A的假想调节区域 的突变将会影 响p n c A基 因的 表达 从而产生 P Z A耐药性 P Z A药物浓度与p n c A 基因突变之 间的联系并不明显 突变菌株 的 P Z A浓 度从 0 t m l 敏感株 到 2 5 O I I l l 高耐药浓度 均 存在 敏感株中存在的突变可能是由于药敏试验在 酸性环境 p I 1 5 5 条件下 临床分离 的有些菌株生 长受到抑制 从而产生错误的药敏结果 目前的文献 报道也未能揭示 P Z A药物浓度与 p n c A基因突变之 间的确切联系 B a ma g a等通过体外实验研究了 P Z A药物浓度与 p n c A基因之间的关系 未得到一定 规律 或许在将来进一步的研究中可通过扩大 样本量 细分药物浓度梯度等方法可找到二者之间 的联系 文献表明 P Z a s e活性丧失与 P Z A耐药性有密 切关系 识别结核分枝杆菌 p n c A基因突变是判断 其耐 P Z A的一个标准 这次实验 的测序结果表 明 P Z a s e阳性 菌株 中 1 9 9 4 6 发生了突变 而 P Z a s e阴性菌株 中 3 1 1 7 5 4 发 生了变异 结果 明显低于国外报道 7 2 一 9 7 p n c A突变率在耐 药菌株中仅 占4 6 2 3 8 5 有 5 4 的耐药菌株未 出现变异 这一结果提示 在中国还存在非p n c A突 9 变的其他 P z A耐药机制 如对 P O A靶标的修饰和 增多 或增 强 P 0 A外 排 也会 影 响 P Z A 耐 药 性 C a t h e r i n e 等的研究亦表明 P z A的耐药机制 主要有 两种 一是丧 失 P Z A a s e活性 二是对 P Z A缺乏 吸 收 帕 因此 在 国内还需对 P Z A耐药机制作 进一 步研究 以发现其它机制 参考文献 1 R a m a s w a m y S Mu s s o r J M Mo l ecu l a rg e n e ti c b a s i s o f a n t i mi c r o b i al a g e n t r esi s a t a n c e i nMy c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s 1 9 98 u p d a t e J J T u b e rcl e a n d lu n g D i s e a s e 1 9 9 8 7 9 1 3 2 9 2 S c o r p i o A L i n d h o l m I X H e i f e t s L e t a1 C h a r a c t e ri z a ti o n o f p n c A mu t a ti o n s i n p y r a z n a mi d e r e s i s t an t My c o b a e t e r i u m t u b e r c u l o s is J J A n t i mi c r o b i al A g e n t s a n d C h e mo t h e r a p y 1 9 9 7 4 1 3 5 4 0 5 4 3 3 Mo r l eck G P C raw f o r d J T B u tl e r WR e t a 1 P h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f c A m u t a n t s o f My e o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s is J A n t i mic r o b i a l A g e n ts and C h e m o t h e r a p y 2 0 0 0 4 4 9 2 2 9 1 2 2 9 5 4 S r e e v a t s a n S P a n X Z h ang Y e t a1 Mu tat i o n s a s s o c i a t e d w i t h p y nu i n a mi d e r esi s t a n ce i n pn c A o f My c o b ac t e r i u m t u b e r c u l o s is c o mp l e x o r g a n i s ms J A n fi mi e r o b i al A n ts and C h e mo t h e r a p y 1 9 9 7 4 1 3 6 3 6 6 4 0 5 H i r a n o K T a k a h a s h i M F u k a s a w a Y e t a1 M u ta t i o n s i n p n c A i s a m a j o r me c h ani s m o f p y r a z i n a mi d e res i s t a n c e i n My c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s is J J T u b e rcl e and L u n g D i s e a s e 1 9 9 8 7 8 2 1 1 7 1 2 2 6 C h e n g S J T h i b e r t L S a n c h es T e t a t p t w A Mu ta ti o n s a s a ma j o r mec h a n i s m o f p y raz i n a mi d e Re s i s t a n c e i n My c o b a ae r l u m t u b er c u l o s is s p r e a d o f a m o n o r e s i s ta n t s t r a i n i n Q u e b e c C ana da J A n t i m i c r o b i al A g e n ts and C h e m o the rap