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文档简介
粪大肠菌群的测定(多管发酵法)一、 检测限二、 试剂(均为分析纯) 1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液(1份量)(因有固体培养基,以下配置方法仅做参考)单倍乳糖蛋白胨培养液成分:蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(1mL):称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯,用少量95%乙醇溶解,移至100mL容量瓶,用95%乙醇多次洗小烧杯,洗液移入容量瓶,最后用95%乙醇定容至100mL,摇匀备用。(滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫)碳酸钠(10.6g):称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水,并定容到100mL。(100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠)将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中,调节pH为7.27.4(用10%碳酸钠调节),再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中,于高压蒸汽灭菌器中,在115灭菌20min,贮存于暗处备用(冰箱中可存放3个月)。(1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套(小试管(12x150mm )+小套管(杜氏小管)(约 6mm 36mm ))、高压蒸汽灭菌器、试管架(10只入)、纱布和棉花) 2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液:制法同上,除蒸馏水外,其余配方比例三倍。3、EC培养液(1份量) 将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g、氯化钠5g,加热溶解于1L烧杯中,然后分装于含有玻璃倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右(确定值需要前期在实验室寻找规律)。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中,115灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。(1L烧杯1只)在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养基颜色变化,或体积明显变化时废弃不用。三、耗材和仪器1、仪器:高压蒸汽灭菌器、生化培养箱(恒温箱)(25-44)、无菌操作台、天平2耗材:倒置的小玻璃管的试管70套(小试管(12x150mm)+小套管(杜氏小管)(约 6mm 36mm ));与小试管配套的棉塞或纱布和棉花;药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸(1盒)、1mL及10mL移液管各2支 三、实验步骤1、 水样接种量将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管(平行)。使用的水样量可参考下表。水样种类检测方法接种量(ml)100501010.110-210-310-410-5井水多管发酵法河水、塘水多管发酵法湖水、塘水多管发酵法城市原污水多管发酵法(如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL;如接种量为1ml或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中)2、 初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管(含有玻璃倒管的试管)中(取原水样1mL,加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL,再按这个方法再稀释一次,就可以得到1mL相当于0.01ml的稀释液了。这时候取1mL加入发酵管中即可)。在370.5下培养24h2h(箱内温度一定要达到所要求的温度(37.50.5)时,方可放入,下同)。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。(培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂,细菌产酸后,培养液即由原来的紫色变成黄色。)产酸产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。(需20支同规格试管)记录:初发酵阳性管数5个接种量为1mL管5个接种量为0.1mL管5个接种量为0.01mL管阳性管数3、 复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用3mm接种环或灭菌棒(2-3环)将培养物转接到EC培养液中。在44.50.5下培养24h2h(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面,提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长)。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察,发酵管产气则证实为菌群阳性。记录:复发酵阳性管数由接种量为1mL管转接由接种量为0.1mL管转接由接种量为0.01mL管转接阳性管数Ps:接种过程(亦有参考视频可供学习) 接种前的准备工作。a检查接种工具,进行环境消毒。b在欲接种的培养基试管上贴好标签,标上接种的菌名、操作者、接种日期等。c将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好,进行环境消毒。 接种方法接种方法: 斜面接种 将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列,挟于左手的拇指与其他四指之间,用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。置试管口于酒精火焰附近。将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红,再横过火焰3次,然后再放入有菌试管内,在管壁上停留片刻待其冷却。取少许菌种置于另一支试管中,按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。取出接种工具,试管口和棉塞进行火焰灭菌。重新塞上棉塞。烧死接种工具上的残余菌,把试管和接种工具放回原处。4、 计算(参考HJ/T 347-2007)其他问题:1、样品的保存: 采样用的容器使用前应盖好瓶盖,用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好,置干燥箱160-170干热灭菌2h,或用高压蒸汽灭菌器121灭菌15min。采样后水样的正确保存也很重要,如保存不当可使样品中的大
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