DNA重组之目的基因的分离（.ppt

Review 第三部分目的基因的分离 目的序列已知 一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因 目的序列未知 差异表达序列无差异表达的目的序列 可采用文库筛选法 功能蛋白分离法 序列克隆法 一 目的基因的功能克隆 根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息 在获知基因的功能后克隆其具体作法是 在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库 然后从文库中筛选目的基因 1 将纯化的蛋白质进行氨基酸测序 据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因 2 将相应的编码蛋白制成相应抗体探针 从cDNA表达文库中筛选相应克隆 二 序列克隆法 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离 三 差别杂交法 适用范围 组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因受生长因子调节的基因经特殊处理诱导表达的基因 应用前提 基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达 一个细胞群体中正常表达 另一个细胞群体中目的基因不表达 基本过程 制备两种细胞群体的的mRNA提取物以两种总mRNA或cDNA为探针以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库有目的基因表达的mRNA探针 重组体菌落阳性反应目的基因不表达的mRNA探针 除目的基因之外 其余菌落都为阳性反应比较底片 对照原板 可挑选出含选目的基因的菌落 cDNA文库母板 目的基因有表达 目的基因无表达 无 有 无 有 说明含目的基因 说明含目的基因 四 减法杂交技术 又称差减杂交 扣除杂交 减数杂交 消减杂交本质 尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列 从而使目的基因序列得到有效的富集 从而提高基因筛选分离的敏感性两种策略 mRNA减法杂交基因组减法杂交 mRNA减法杂交 提取表达目的基因的细胞mRNA 反转录成cDNA提取不表达目的基因的细胞mRNA过量杂交两种组织中均表达的基因产物形成cDNA mRNA杂交分子特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链 减数杂交技术分离差异表达基因 DNA RNA杂交分子可结合在羟基磷灰石柱上 而游离的单链cDNA则过柱流出 回收的cDNA转变为双链cDNA后克隆倒适当的载体中 就成为一个减数文库 五 mRNA差别显示技术 又称为差别显示反转录PCR DDRT PCR 目的序列未知 1992年由美国哈佛大学医学分校Dena Farber研究所的两位科学家Liang和Pardee首次提出的 并运用这种方法来分离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基因 至今 运用mRNA差别显示技术分离 鉴定的差别表达基因大约有300多个 3 端锚定引物 锚定引物的通式是oligo dT 12MN 其中M为A C G中的任意一种 N为A C G或T中的任意一种 所以共有12种oligo dT 12MN引物 用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成 即进行12次不同的反转录反应 每一种3 端锚定引物 都能够把总mRNA群体的1 12分子反转录成mRNA cDNA杂交分子 这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上 分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体 这一过程叫做差异显示反转录 即DDRT 5 端随机引物 另外 还需要另外一种由10个核苷酸组成的5 端随机引物 这种5 随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用 而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3 端的不同位置上 用3 端锚定引物和5 随机引物组成的引物对 以mRNA cDNA为模板进行PCR扩增 然后经过2 3h的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 可以显示出在100 500bp之间的DNA条带 20种5 端随机引物12种3 端锚定引物240组引物 进行PCRPCR过程中加入放射性标记变型聚丙烯酰氨凝胶电泳放射自显影显示差异表达条带对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针 从文库中筛选 差别显示分析基本流程 基本程序 提取两种细胞的总mRNA 反转录后成为2种cDNA以一定的引物作随机聚合酶链反应通过扩增产物的电泳分析 分离出不同样品间的差异条带将差异DNA做成探针在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析 优点 几乎可检测细胞表达的所有基因可同时比较多种细胞类型可同时展现所有差异用量少 操作简单 快速高效 缺点 12种锚定引物和20种随机引物 240次PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于500bp有些差别条带成簇出现 造成假阳性缺乏定量分析手段 判断差异条带有难度 第六章DNA重组的操作 第一节受体细胞 易于重组DNA分子的导入能使重组DNA分子稳定存在于细胞中便于重组体的筛选遗传稳定性高安全性高有利于外源基因的高效分泌表达在遗传密码的应用上无偏倚性具有较好的转译后加工机制有较高的应用价值 1 原核生物细胞 是较为理想的受体细胞 大多原核生物没有坚硬的细胞壁没有核膜 有利于外源片断重组基因组简单 便于对外源基因进行遗传分析多为单细胞生物 繁殖迅速 过程简单 缺陷 以原核生物表达真核生物基因存在问题 很多真核生物基因不能在E coli中表达具生物活性的功能蛋白 缺乏真核生物蛋白质折叠复性系统缺乏蛋白质加工系统原核生物内源蛋白易降解空间构象不正确的异源蛋白 造成表达产物不稳定 常用受体菌 大肠杆菌人胰岛素 生长素 干扰素等枯草杆菌人 干扰素 白细胞介素乙肝病毒核心抗原等蓝藻易于表达植物基因 2 真菌细胞 低等真核生物 酵母菌 以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物 易于表达外源真核基因 基因结构最为简单的真核生物之一具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统不含有特异性病毒 不产生毒素培养简单可将外源基因表达产物分泌至胞外 3 植物细胞 坚硬的细胞壁纤维素酶处理 原生质体摄取外源片断 全能性 在合适的培养条件下 一个分离的活细胞可分化成植株 水稻 棉花 玉米 马铃薯 烟草等 4 动物细胞 早期 生殖细胞 受精卵细胞或胚细胞现在 体细胞培养 动物 猪 羊 牛 鱼 鼠 猴等生产天然状态的复杂蛋白质动物疫苗动物品种的遗传改良人类疾病的基因治疗 第二节重组体导入受体细胞 2 1重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化 transformation 定义转化微生物的种类感受态细胞P139转化过程 供体 donor 提供DNA的生物受体 recipientorhost 获得DNA的生物 1 定义转化 受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象 转化子 transformant 通过转化方式而形成的杂种后代 2 转化微生物的种类首次发现转化现象肺炎链球菌 Griffith 1928 嗜血杆菌属 芽孢杆菌属 奈瑟氏球菌属 根瘤菌属 葡萄球菌属 假单胞菌属 黄单胞菌属等 3 感受态 competence 感受态 指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态 感受态是细菌的一种遗传特性 而且也受生长阶段 培养条件的影响 肺炎链球菌对数生长后期芽孢杆菌属指数期末和稳定期大肠杆菌刚进入对数期 DH5 菌株的OD600为0 5时 细胞密度在5 107个 ml左右 大肠杆菌革兰氏阴性菌细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同转化因子的吸收较为困难人工制备感受态细胞 4 转化过程 大肠杆菌的转化方法 Ca2 诱导大肠杆菌转化法电穿孔转化法三亲本杂交接合转化大肠杆菌 1 Ca2 诱导大肠杆菌转化法 培养生命活动旺盛的菌体菌种分纯活化 扩大培养 处于对数生长期沉淀菌体冰水浴中预冷10分钟 4 离心化合物处理含CaCl2无菌预冷缓冲液处理DNA分子转化感受态细胞 制备感受态细胞的注意事项 1 细胞生长状态和密度 不要用经过多次转接或储于 的培养菌 最好从 70 或 20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好 可通过监测培养液的OD600来控制 DH5 菌株的OD600为0 5时 细胞密度在5 107个 ml左右 不同的菌株情况有所不同 这时比较合适 密度过高或不足均会影响转化效率 2 质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA cccDNA 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时 转化效率就会降低 1ng的cccDNA即可使50 l的感受态细胞达到饱和 一般情况下 DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 3 试剂的质量 所用的试剂 如CaCl2等均需是最高纯度的 GR 或AR 并用超纯水配制 最好分装保存于干燥的冷暗处 4 防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行 所用器皿 如离心管 tip头等最好是新的 并经高压灭菌处理 所有的试剂都要灭菌 且注意防止被其它试剂 DNA酶或杂DNA所污染 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入 为以后的筛选 鉴定带来不必要的麻烦 感受态细胞的制备 1 挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2mLLB液体培养基中 37 振荡培养过夜2 按1 的接种量接种于3mL新鲜LB培养液 37 剧烈振荡培养至OD600为0 4 0 6 可见雾状 3 倒至1 5mL的eppendorf管中 4 下12 000rpm离心1min 倒出培养液 用无菌滤纸尽量吸干4 加入1mL预冷的无菌0 1mol L 1CaCl2溶液涡旋 4 下12 000rpm离心30秒 尽量去除上清5 沉淀以50 100 L预冷的0 1mol L 1CaCl2重悬 4 保存备用 7d内可用 细胞的转化 2ul重组DNA 50ul感受态细胞混匀 冰浴30min 42 热激90 120S 冰浴2min 复苏 加入450ul液态LB培养基 37 轻缓振荡培养 150rpm 1 5 2h 取30 50ul 涂布在含相应抗生素的培养基上 平板培养 挑取单菌落 于含相应抗生素的液态培养基培养后 取一定量提取质粒 进行鉴定 酶切 杂交 测序等 CaCl2的诱导原因 在0 的CaCl2低渗溶液中 细菌细胞发生膨胀 Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构 促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离 诱导形成感受态Ca2 能与加入的DNA分子结合 形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基 磷酸钙复合物 黏附在胞膜的外表面 42 热激处理 细胞膜的液晶结构发生扰动 出现间隙 提高转化效率的因素 MgCl2与CaCl2共同处理二甲基亚枫 DMSO 二硫苏糖醇 DTT 提高100 1000倍 易污染RbCl MnCl2 LiCl和KCl等与CaCl2多盐处理 对照处理 DNA对照处理 无菌水代替感受态细胞 检验DNA溶液感受态细胞对照处理 NTE缓冲液代替DNA溶液 检验感受态细胞感受态细胞有效性对照处理 加入已知的容易转化的质粒DNA 原因 转化处理过程中 可能感染杂菌 导致假阳性 2 电穿孔转化法 P140 基本原理 利用高压电脉冲作用 在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔 形成可逆的瞬间通道 促进外源DNA的有效吸收 影响因素 电场强度 电脉冲时间 外源DNA浓度 菌体制备冷却 离心 洗涤 降低离子强度 10 甘油重悬细胞 70 贮存低温下 0 4 进行电穿孔转化 3 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 根据非接合质粒的迁移作用而建立 目前常用的载体多是在非接合型质粒或缺少了接合转移基因的接合型质粒的基础上而构建的 待转化的受体菌含有要转化的重组质粒的供体菌含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌 如 辅助菌株E coli pRK2013 4 转化率 DNA分子转化受体菌获得转化子的效率 以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示P150 影响转化率的因素 重组DNA分子质量较小 亲和性强 双螺旋闭合结构受体细胞受体细胞的选择非常重要转化手段电穿孔法 Ca诱导法 三亲本杂交法 2 2重组 DNA分子转导大肠杆菌 转染 将重组 DNA分子直接导入受体细胞的过程 转导 通过 噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程 P142转化 139 2 3重组DNA分子导入植物细胞 P144 1 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法革兰氏阴性菌 作用机制 将待转移的目的基因组入农杆菌中的Ti质粒载体农杆菌识别敏感植物 将Ti质粒的T DNA转移到植物细胞内部 选择合适的外植体根据受体细胞的转化能力来决定农杆菌的接种操作 接种到损伤切面 使农杆菌与外植体共培养 洗菌并筛选培养 无菌水清洗共培养后的外植体 无菌滤纸吸干后转移到筛选培养基上 杀死或抑制附着于表面的农杆菌 农杆菌介导外源基因转化植物的基本程序 创伤植株感染法 植株接种共转化法 共培养感染法叶盘转化法植物愈伤组织共培养转化法植物悬浮细胞共培养转化法原生质体共培养转化法 常用方法 创伤植株感染法 植株接种共转化法 在整体植株上造成创伤农杆菌接种在创伤表面或针头注射农杆菌农杆菌以天然的感染过程在植株体内感染获得转化的植物愈伤组织 共培养感染法 叶盘转化法植物愈伤组织共培养转化法原生质体共培养转化法植物悬浮细胞共培养转化法 叶盘转化法 叶子表面进行消毒 再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片接种处理 放在农杆菌培养液中浸泡数秒钟滤纸吸干 看护培养基上进行培养培养两天后 滤纸连同叶盘转移到含有选择药物的 长芽 培养基中 筛选与再生培养转移到 生根 培养基上诱导幼芽生根 植物愈伤组织共培养转化法 愈伤组织与农杆菌共培养抗生素筛选培养诱导分化植株再生 2 DNA的直接转移法 多聚物介导法电穿孔转化法激光微束穿孔转化法显微注射法 超声波介导转化法基因枪法脂质体介导法花粉管通道法 基因枪法P146 将DNA吸附在由钨制作的微型子弹 直径约为1 2um 表面通过特制的手枪 将子弹