马链球菌兽疫亚种类 基因和猪链球菌 基因片段的融合表达及仔猪免疫.pdf

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型 mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验 范红结1 陆承平1 3 唐家琪2 11 南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室 江苏 南京210095 21 南京军区军事医学研究所 江苏 南京210002 摘要 将含猪链球菌2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 21 经异丙基硫代2 2 D2半乳糖苷 IPTG 诱导 表达了相对分子质量为60 000左右的融合蛋白 利用组氨酸亲和层析柱 获得了纯化的融 合蛋白 质量浓度为412 g mL 1 以纯化的融合蛋白 宿主菌 BL 21经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清 马链球 菌兽疫亚种ATCC 35246株和猪链球菌2型HA 9801株制备的二联灭活苗为免疫原 分别免疫30头仔猪 初次免疫1月 后 以同样的剂量再次免疫 3周后以5 LD50的ATCC 35246和HA 9801强毒株进行攻击 结果 纯化融合蛋白免疫组 的免疫保护率达60 BL 21上清免疫组的免疫保护率为50 全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达90 关键词 猪链球菌2型 马链球菌兽疫亚种 融合蛋白 免疫 中图分类号 S852161 1 文献标识码 A 文章编号 10002030 2003 04007804 Fusion expression ofStreptococcus equisubsp1zooepidemicus M2like gene fragment andS suistype 2mrpgene fragment and evaluation of its immune protection in piglets FAN Hong2jie1 LU Cheng2ping1 3 TANGJia2qi2 11Key Laboratory of Animal Disease Diagnostic and Immunology Ministry of Agriculture Nanjing Agric Univ Nanjing 210095 China 21Institute of Military Medical Science Nanjing Military Area Nanjing 210002 China Abstract Streptococcus suistype 2 andS1equisubsp1zooepidemicusare the major pathogens in swine in China A recombi2 nant plasmid harboring 484 bp fragment ofStreptococcus equisubspzooepidemicusM2like protein gene and 528 bp fragment of S1suistype 2mrpgene was transformed into its host strain BL21 The fusion gene encoded the recombinant protein of 339 amino acid The expression product was purified by his2nitrilotriacetic acidaffinity chromatography and hada molecular weight of 60 000 by SDS2PAGEanalysis Thirty non2immunized piglets were divided into three groups Two groups of piglets were sub2 cutaneously immunized respectively with the purified recombinant protein and the supernatant protein of the recombinant plasmid2containingE1coliBL21 culture subjected to IPTG induction and ultrasonic treatment both at a protein concentration of 412 g mL 1 with white oil as adjuvant Piglets of the third group were immunized with the inactivated vaccine withStrep2 tococcus equisubsp1zooepidemicusM2like gene fragment andStreptococcus suistype 2 as control All the immunized animals were challenged with the corresponding virulent bacterial strains after the second vaccination The inactivated vaccine hadapro2 tection rate of 90 while the purified protein offereda 60 protection against the challenge The protective rate was 50 for the group of animals receiving ultrasonic treated supernatant protein All piglets without vaccination died within one week Key words Streptococcus suistype 2 Streptococcus equisubsp1zooepidemicus fusion protein immunity 收稿日期 20030514 基金项目 国家973项目子课题 G1999011906 作者简介 范红结 1968 讲师 博士 主要从事兽医微生物学与免疫学的教学和科研工作 3通讯作者 Corresponding author Tel Fax 86254396517 E2mail lucp njau1edu1cn 南京农业大学学报 2003 26 4 78 81 Journal of Nanjing Agricultural University 1994 2007 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 猪链球菌病其病原主要是猪链球菌2型 S1suistype 2 和马链球菌兽疫亚种 S1equisubsp1 zooepidemicus 是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一 还可感染人类 引起脑膜炎 败血 症等疫病 1 4 对该病的防制 目前仍缺乏有效的手段 更没有高效的二联疫苗 国内尽管有预防马 链球菌兽疫亚种的ST171弱毒疫苗 但安全性上存在隐患 马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌2型MRP是以上两种细菌表面重要的生物大分子 具有良 好的免疫原性 是该菌重要的保护性抗原 5 6 范红结等已成功将猪链球菌2型mrp及马链球菌兽疫亚 种类M基因的免疫功能片段进行了融合 并构建了重组表达质粒 7 本试验将重组质粒进行了高效串 连表达 并以该融合蛋白为免疫原 对猪群进行免疫保护试验 以评价该融合蛋白对仔猪的免疫保护作 用 为开发预防猪链球菌病的二联亚单位疫苗进行有益的探索 1 材料与方法 111 实验材料 11111 菌种 马链球菌兽疫亚种ATCC 35246株 1976年分离自我国四川的病猪脏器 上海市兽医站 提供 猪链球菌2型HA 9801株 由姚火春等从江苏某发病猪场分离 8 11112 质粒及宿主菌 重组质粒pET2S2M 由范红结等构建 大肠杆菌BL 21 DE3 由南京农业大 学兽医微生物与免疫学学科组保存 7 11113 实验动物 实验猪为安徽省地方优良品种定远猪 由安徽芜湖某养猪场提供 重约8 kg 免疫 前饲养1周 确证无病 112 实验方法 11211 重组质粒的表达及融合蛋白的含量测定 按文献 9 介绍的方法 将重组质粒pET2S2M转化 感受态大肠杆菌BL 21 以含氨苄青霉素 Amp 平板筛选 挑取单菌落接种含Amp的LB肉汤5 mL 28 摇振4 5 h 再接种含Amp的LB肉汤1 000 mL 28 剧烈摇振4 5 h 当A600达016时 加 IPTG诱导 37 剧烈摇振3 4 h 将500 mL菌液离心 以10 mmol L 1PBS pH712 溶液洗涤沉 淀2次后 再加入50 mL PBS溶液重新悬浮沉淀 以超声粉碎仪进行破碎 10 000g离心10 min 收 集上清 取20 L离心后的上清 加等量SDS2PAGE上样缓冲液 煮沸5 min 以同样处理的BL 21空 宿主菌作为对照 进行SDS2PAGE 电泳后凝胶经染色 脱色后 以薄层扫描测定融合蛋白占总蛋白的 含量 同时以紫外蛋白检测仪 Smart SpecTM3000 测定上清内菌体蛋白的总量 11212 重组融合蛋白的纯化及免疫原的制备 将收集的上清 以组氨酸亲和层析柱层析 QIAGEN公 司产品 纯化重组蛋白 并以BIO2RAD Smart SpecTM3000 测定收集蛋白的浓度 具体操作按使用 说明书进行 11213 马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型二联灭活疫苗的制备 将ATCC 35246和猪链球菌2型HA 9801分别接种含5 犊牛血清的THB培养基 37 静置培养16 h 加入终体积为018 的甲醛溶液 37 灭活24 h 将灭活的各组菌液离心 沉淀以灭菌的10 mmol L 1 PBS pH 712 稀释至1 10 9 CFU mL 1 加入10 的氢氧化铝铝胶制备免疫用疫苗 将重组菌上清的融合蛋白和纯化融合蛋白调 整浓度至410 mg mL 1 加等量10号白油 以均质仪乳化 制备免疫原 11214 动物免疫试验 将40头仔猪分成4组 每组10头 第1组用灭活的二联苗免疫 第2组用纯 化的融合蛋白免疫 第3组用重组菌上清免疫 每组每头猪颈部肌肉注射1 mL 初次免疫1月后 加 强免疫一次 再次免疫2周后 连同对照组 非免疫 分别以5倍LD50的ATCC35246和HA 9801强毒 菌株分别或联合攻击 记录每组的死亡猪头数 2 结 果 211 融合基因片段的表达及相对含量分析 重组菌上清经SDS2PAGE表明 在IPTG诱导下 转化有重组表达质粒的BL21表达了相对分子质 量约60 000的重组融合蛋白 且蛋白条带浓厚 对照BL21中未见相应蛋白 图1 97 第4期 范红结等 马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验 1994 2007 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 利用薄层扫描技术对电泳条带进行分析发现 表达的目的条带占菌体总裂解蛋白的3713 表 明ATCC 35246株类M基因片段和HA 9801mrp 基因片段的融合基因得到了高效表达 表1 212 重组蛋白的纯化 IPTG诱导的重组菌经超声波破碎后 离心 收集的上清经QIAgen His亲和层析柱层析 收集 洗脱液 洗脱液经SDS2PAGE 得到一条纯化的 蛋白条带 图2 相对分子质量与表达的融合蛋 白相同 经紫外蛋白检测仪 Smart SpecTM3000 测定 其含量为4162 mg mL 1 213 免疫猪攻击试验结果 在强毒菌株攻击下 二联苗免疫组两周内有 1头猪发病死亡 融合蛋白免疫组攻击后第5天 有 一头猪死亡 两周内共有4头猪死亡 上清免 图1 重组融合蛋白表达产物的SDS2PAGE Fig11 SDS2PAGE of expression products 11BL 21 harboring pET322a 21Recombinant plasmid be2 fore IPTGinduction 361Recombinant plasmid after IPTG induc2 tion 71Marker 疫组第6天开始有猪死亡 两周内共有5头猪死亡 对照组全部发病死亡 表2 表1 IPTG诱导的重组菌破碎上清各电泳条带薄层扫描相对含量分析 Table 1 Analysis of recombinant protein by TLC2scanning 条带 Band 含量 Volume 相对含量 Relative content 条带 Band 含量 Volume 相对含量 Relative content 条带 Band 含量 Volume 相对含量 Relative content 13 3291530128762 26012251281350 2461074126 29 0251630177861 86516151251438 8171723129 332 7311322180982 71111071021541 8521723155 439 57212831361045 52111431861657 7041304189 5 439 673100371301171 24111961041726 5241862124 678 98717061691227 9091272137188 9521530175 表2 融合蛋白的免疫保护效力试验 Table 2 Immune protection of recombinant fusion protein against challenges byS suistype 2 andS equisubsp1 zooepidemicusATCC 35246 免疫原 Immunogen 接种剂量 头 Inoculate dose 攻击菌 Challenge bacterium 死亡数 总数 No1of death total 保护率 Survival percentage 二联灭活苗Inactivated combined vaccine1 109CFUHA9801 ATCC352461 1090 融合蛋白Fusion protein2 mgHA9801 ATCC352464 1060 菌体上清Surpernatant2 mgHA9801 ATCC352465 1050 非免疫对照1 Non2immunized control 10HA98015 50 非免疫对照2 Non2immunized control 20ATCC352465 50 图2 纯化融合蛋白的SDS2PAGE Fig12 SDS2PAGE of purified fusion protein M1Marker 131The purified recombinant fusion protein 3 讨 论 马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌 MRP为重要的保护性抗原 Hoffman等曾研制了 马亚种类M蛋白亚单位疫苗 并已成功用于马腺 疫的防制 10 Dale等根据A群链球菌M蛋白的 N未端区含有主要的保护性抗原决定簇 制备3 24 5及19血清型的四价亚单位重组疫苗 可产 生针对M蛋白的调理素抗体 11 猪链球菌2型 MRP和马链球菌兽疫亚种的类M蛋白同属于类 M蛋白超家族成员 12 类M蛋白和MRP的结 08 南 京 农 业 大 学 学 报 第26卷 1994 2007 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 构相似 因而将以上两种基因融合并高效串联表达 研制二联重组亚单位疫苗 在理论上是可行的 作者和苏良科等分别克隆和表达了猪链球菌2型mrp基因片段和马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因 片段 其表达产物免疫小鼠约有70 的免疫保护率 7 13 本实验融合表达的类M与mrp基因片段的融 合蛋白 通过免疫转印和ELISA证实 具有类M蛋白和MRP的双重抗原性 7 因融合蛋白的相对分 子质量加大 其免疫原性会更加优于单独表达的产物 故更有可能应用于临床免疫的实践 仔猪免疫试验证实 表达的类M与mrp基因片段的融合蛋白对仔猪的免疫保护率为60 低于马 链球菌兽疫亚种ATCC35246株和猪链球菌2型HA9801株制备的二联灭活疫苗 达90 但全菌灭活 疫苗有一定缺陷 如注射剂量大 以及灭活工艺存在安全性隐患等 开发新型疫苗是猪链球菌疫苗研制 的主要方向 参考文献 1 Clifton2H adley F A Streptococcus suistype 2 infections J Br Vet J 1983 139 1 5 2 Vecht UL van Leengoed M G Verheyen RM Streptococcus suisinfections in pigs in the Netherlands part one J Vet Q 1985 7 315 321 3 Arends J P Zanen H C Meningitis caused byStreptococcus suisin humans J Rev Infect Dis 1988 10 131 137 4 刘佩红 沈素芳 王永康 等 上海地区猪源链球菌特性鉴定 J 中国兽医学报 2001 21 1 42 46 5 Timoney J F Walker J Zhou M et al Cloning and sequence analysis of a protective M2like gene fromStreptococcus equisubsp zooepidemicus J Infect Immune 1995 63 1440 1445 6 Hilde E Vecht Uri Gielkens Arno L J et al Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the 136000 surface protein mu2 ramidase2released protein ofStreptococcus suistype 2 J Infect Immun 1992 60 2361 2367 7 范红结 猪源链球菌类M基因的克隆 序列分析 表达及动物免疫试验 D 南京 南京农业大学 2003 8 姚火春 陈国强 陆承平 猪链球