重组质粒的构建.doc

目录实验流程2实验操作31.LB液体培养基的配置32.质粒的提取43.琼脂糖凝胶电泳54.PCR6 5.DNA片段的回收纯化 .7 6.目的片段与载体连接及转化.87.菌种保藏.98.双酶切反应.10实验流程质粒构建基因提取1、2、3PCR反应扩增目的基因4、3DNA片段回收5、3目的片段与载体连接及转化6菌种保藏7重组质粒提取2、3重组质粒检测：（1）PCR（2）双酶切8、5测序实验操作1LB液体培养基的配置【器材】锥形瓶，烧杯，量筒，分析天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，棉花，报纸，记号笔，麻绳，纱布等。【试剂】酵母提取物(Yeast Extract) ，胰蛋白胨（Tryptone)，NaCl【实验步骤】1. LB液体培养基配方（配置1L培养基）： 胰蛋白胨（Tryptone) 10g 酵母提取物(Yeast Extract) 5g NaCl 10g 若配置50ml培养基，按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物：0.25g、胰蛋白胨： 0.5g、NaCl:0.5g放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的单蒸水，用药匙搅匀。待药品完全溶解后，倒入50ml 量筒中，补充水分到50ml，倒入锥形瓶中。3. 包扎 用棉塞或纱布封住瓶口，再在棉塞外包一层报纸，用绳子以活结形式捆扎好。用记号 笔注明培养基名称、组别、日期。4. 灭菌 将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干。烘干后，4保存。【注】1. 烧杯、量筒、锥形瓶应先用洗涤精洗干净，再用单蒸水润洗。 2. 灭菌后应立即放入烘箱烘干。 3. 培养基存放时间不宜过长。2质粒的提取【器材】加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机【试剂】灭菌水、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 【实验步骤】第一次使用本试剂盒时，请将 RNase A1混浊液全部加入到Solution中，均匀混合后4保存。 实验操作前请将 Solution 置于 4（或冰上）预冷后使用。 1. 大肠杆菌的培养。 从平板培养基上挑选单菌落接种至 14 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37过夜培养。 注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。 2. 取菌液，12,000 rpm离心2分钟，弃上清。 3. 用 250 l 的 Solution （含 RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4.加入 250 l 的 Solution 轻轻地上下翻转混合 56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过 5 分钟。5. 加入 400 l的 4预冷的Solution ，轻轻上下翻转混合 56 次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置5分钟。 6. 室温 12,000 rpm 离心 10 分钟，取上清。 注）此时 4离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 8. 将上述操作 6 的上清液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 9. 将 500 l 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 10. 将 700 l 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。 11. 重复操作步骤10。 12. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube上，12,000 rpm 离心 1 分钟。 13. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入 60 l 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置 1分钟。 注） 把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60使用时有利于提高洗脱效率。 14. 12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。15. DNA经1琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】提好的质粒需标明时间、名称等。-20保存。3.琼脂糖凝胶电泳【器材】分析天平，锥形瓶，量筒，微波炉，凝胶板，梳子，加样枪，Tip头，电泳槽，电泳仪，紫外投射仪【试剂】琼脂糖（Agarose），TAE电泳缓冲液，EB，Marker【实验步骤】1. 称取1g琼脂糖（Agarose）粉末于锥形瓶中，加入100mlTAE。保鲜膜封口，扎孔。2.在微波炉中加热，沸腾两次，直到看不出油滴，形成均一的溶液。3.倒入污染区的锥形瓶中，待冷却至60时加2ulEB，混匀。4. 插入梳子，倒入制胶槽中。5. 室温静置20min.6. 待凝胶全部凝结后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加缓冲液直到没过凝胶为止。7. 按下表加样： 适用于检测DNA（小孔）：Marker(DL2000) 样品1 样品23ul 1ul（6buffer）3ul 1ul3ul 适用于回收DNA（大孔）:Marker(DL2000) 样品1 5ul 17ul（6buffer)100ul(质粒） 6. 电泳15分钟左右。【注】1. 当加入的样品量小于5ul时，6buffer均加1ul。2. 电泳时的加样孔宽度小于6 mm时，每次取 5l制品电泳便可得到清晰条带。如果加样孔增宽，须适当增加Marker制品的加样量。 3. 对 DNA 电泳而言，Agarose 的纯度对 DNA 条带的清晰度影响很大。4. 进行Agarose电泳时， Agarose的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。Agarose 浓度越大，对短片段DNA分离性能越好；反之，Agarose浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。5. 当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。6.若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。7. 本实验室有两种常用Marker,分别为DL2,000 DNA Marker和-EcoT14digest DNA Marker。Agarose 电泳图像示意图如下:4.PCR【器材】加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、PCR扩增仪、冰袋【试剂】DNA模板、引物、灭菌水、buffer、dNTP(mix)、Taq酶【操作步骤】加样前应先打开PCR仪，预热。1. 在0.5mlPCR管中加入下列试剂： 50ul体系： 灭菌水： 38ul 10buffer（LA）： 5ul dNTP: 4ul 质粒： 0.5ul F： 1ul R： 1ul LA(冰上）: 0.5ul 总体积 50.0ul 20ul体系： 灭菌水： 13.35ul 10buffer（EX)： 2ul dNTP（Mix): 2ul 质粒： 0.5ul P1: 1ul P2: 1ul EX(冰上）: 0.15ul 总体积 20.0ul2. 将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。3. 设定程序进行扩增： 94-5min 94-30s 55(退火温度不固定，根据引物进行调整）-1min 72-30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整） 72-7min 共30个循环4. PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】1. 当PCR反应后的产物目的片段还需进行后续操作时，选用LA Taq酶；当PCR反应用于检测时选用EX Taq酶.2. buffer的选择应与酶的选择相对应。例如：LA Taq酶对应的buffer为10LA PCR Buffer.3.在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。这样既节省时间，又节省枪头。5DNA片段的回收纯化 【器材】加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、水浴锅、离心机【试剂】TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 、灭菌水【操作步骤】1. 实验前将水浴锅调到75度；将灭菌水放入烘箱中加热；空管去皮。2. 使用 TAE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。 3. 在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽 量切除不含目的 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。 注）切胶时请注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤。先切后验证。 4. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6 的胶块融化时间，提高 DNA 的回收率。 5. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1 l 进行计算。 6. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表： 凝胶浓度 DR-I Buffer 使用量 1.0 3 个凝胶体积量 7. 均匀混合后 75加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在 45加热）。此时应间断振荡混合， 使胶块充分融化（约 610 分钟）。 注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA的回收率。 8. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。 9. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 10. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 注）如将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。 11. 将500 l的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 12. 将700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。 13. 重复操作步骤11。 14. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离心 1 分钟。 15. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入12.5 l的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置 1 分钟。16. 重复操作步骤15。 注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60使用时有利于提高洗脱效率。 17. 12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。6.目的片段与载体连接及转化【器材】超净台：酒精灯、打火机、加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、摇床、冰袋、水浴锅【试剂】PMD-18载体、目的片段、Solution 、感受态细胞、LB培养基（加Amp)、含AMP的琼脂培养基【实验步骤】1. 实验前水浴准备。2. 在PCR管中加入： PMD-18载体： 1ul 目的片段： 4ul 总体积 5ul3. 再加入5ul Solution 4. 16，连接90min5. 全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置30min.6. 42，热激45s.7. 冰上，1min.8. 加890ulLB培养基（不加Amp)，37摇床培养60min。9. 涂布在含AMP的琼脂培养基上，过夜培养。 （3ml培养基中加入3ul AMP）10. 第二天晚上五点挑菌,在3mlLB培养基(加Amp)中培养,37过夜。7.菌种保藏【器材】超净台：酒精灯、打火机、1ml加样枪、灭菌Tip头【试剂】50的甘油【实验步骤】1. 实验前超净台灭菌。2. 将500ul50的甘油与500ul菌液混合，-80保存。8.双酶切反应【器材】水浴锅、灭菌Tip头、0.5mlPCR管、加样枪【试剂】Buffer、限制酶1、限制酶2、重组质粒、灭菌水【实验步骤】、1. 实验前水浴准备。2. 在0.5mlPCR管中加入下列试剂： 体系： 灭菌水： 5ul