分子生物学综合性实验讲义.doc

分子生物学综合性实验生命科学与生物制药学院生物制药研究所分子生物学综合性实验教学小组2010年12月分子生物学实验内容与流程一、 实验内容1、 小鼠肝脏总RNA提取2、 RT-PCR、扩增产物电泳鉴定与纯化3、 扩增产物克隆4、 转化子筛选与PCR鉴定5、 重组质粒提取与酶切鉴定二、 流程日期 实验内容 20/12：小鼠肝脏总RNA提取RT-PCR：逆转录、-20冻存21/12:RT-PCR：PCRRT-PCR产物电泳鉴定与回收接种DH5RT-PCR产物与T载体连接宿主菌感受态制备22/12转化、涂平板转化子蓝白斑筛选23/12转化子PCR鉴定重组子接种重组子质粒制备24/12重组子酶切鉴定实验要求与质量控制 综合实验涉及的知识点和实验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合实验之最大成效，以下对本综合实验过程的要求进行说明，且纳入实验考核成绩。1、预习 实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。2、实验过程除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外，还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。为此，本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入实验成绩中。要达到此目的，同学们必须提前仔细阅读实验讲义，全面了解实验内容，透彻理解实验原理，熟悉各个操作步骤，并在实验过程中合理安排时间。3、实验原始记录与结果整理 每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因，并将下述关键性实验情况整理于实验记录本上，并于当天由带教老师签阅： 1） 记录日期、天气2） 实验名称、负责人3） 原理（简述）4） 实际操作情况5） 实验结果6） 分析4、综合实验报告 须按下述规范撰写、并提交综合实验报告（电子版及电子打印版）。1）封面：见下一页。2)论文内容目录中文摘要英文摘要前言材料与方法结果与讨论1 总RNA提取与RT-PCR：PCR产物电泳凝胶扫描图、PCR产物回收电泳凝胶扫描图。2 RT-PCR产物克隆：转化筛选平板照片3 重组子PCR鉴定：PCR鉴定电泳凝胶扫描图4 重组质粒提取与酶切鉴定：酶切鉴定电泳凝胶扫描图参考文献致谢分子生物学综合性实验论文小鼠-actin基因的克隆姓名： 班级： 学号：生命科学与生物制药学院实验一 小鼠肝脏总RNA提取实验目的1掌握真核细胞总RNA提取的方法与注意事项2了解真核细胞总RNA提取的原理实验原理RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定性和定量检测，从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5gRNA，其中约82%为rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型），16%为tRNA和核内小分子RNA，2%为mRNA。这些高峰度的RNA，如rRNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。而mRNA虽然大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸纤维素oligo(dT) ，使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。真核细胞总RNA制备方法有多种，包括异硫氰酸胍氯化铯超速离心法、盐酸胍有机溶剂法、氯化锂尿素法、热酚法以及Trizol试剂提取法等。目前实验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法酚氯仿一步法和Trizol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了核蛋白复合物的解离，使RNA和蛋白质分离并进入溶液，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩。我们这次实验采用的是Trizol试剂提取法。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，同时还抑制RNA酶，防止RNA的降解。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚使蛋白变性，可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。1 抑制内源性RNA酶。主要运用RNA酶抑制剂，目前常用的RNA酶抑制剂有： RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)，它是从人胎盘分离的一种蛋白质，可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物，使RNA酶失活。RNA酶抑制剂经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译；氧钒核糖核苷复合物，它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态似物，它能与多种RNA酶结合并高效抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以除之；硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去；异硫氰酸胍，它是强力的蛋白质变性剂，在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活；焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的。DEPC主要用于材料和器皿的RNA酶处理；其它化学试剂，如SDS、尿素等对RNA 酶也有一定的抑制作用。2防止外源性RNA酶污染外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品：玻璃制品、塑料制品和电泳槽；研究人员造成的污染；污染的溶液。因此在实验中必须采取下列措施抑制外源性RNA酶：实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不需要处理；在RNA提取过程中,应戴一次性手套和口罩,对接触可能污染的器皿时，应勤换手套；配制的溶液的水应用0.1%DEPC水在37处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂，用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制。仪器与试剂1仪器与材料：低温高速离心机、移液器、DEPC水处理的EP管与枪头、一次性手套、组织研磨棒、眼科剪、眼科镊、止血钳2试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇实验步骤1. 吸取500L Trizol加入一新的DEPC处理后的1.5mL EP中；2. 解剖小鼠，取小鼠肝脏组织，在生理盐水中清洗后，剪成大小约黄豆大小（重量约100 mg）, 放入已加有500L Trizol的1.5 mL EP中；3. 使用用组织研磨棒快速研磨4-5次，之后再加入500L Trizol，继续快速研磨2-3次研磨组织直至溶液变粘稠，室温放置5min使其充分裂解；4. 12000rpm离心5min，将上清转移至一新的DEPC处理后的1.5mL EP中；5. 加入200L 氯仿，振荡混匀，室温放置3 min；6. 12000 rpm离心15 min；7. 离心后混合物分为三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。小心移取上层无色水样层，转移至另一新EP管中；8. 加入500L异丙醇，室温放置15 min；9. 12000 rpm离心15 min，这时会在EP管的底部看到白色沉淀；轻轻弃去上清；10. 加入1 mL 75乙醇（用DEPC处理的水配制）洗涤RNA沉淀；11. 7500 rpm离心5 min, 弃上清；12. 将EP管倒置，干燥，挥发剩余的乙醇；13. 用适量DEPC处理的水溶解RNA沉淀，推荐20L。注意事项1. 研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2. 研磨过程中要尽量避免Trizol的溢出。3. 有多次离心过程，注意配平，防止出现事故以及对离心机的损害。4. 整个抽提过程，要尽量避免RNase的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。实验二 RTPCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定实验目的1 掌握RT-PCR的基本原理和基本操作步骤。2 了解常用的PCR产物的回收方法，并掌握一种琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA的原理及方法。3 掌握琼脂糖电泳的基本技术。实验原理1. RT-PCR获得组织或细胞中的总RNA后以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）、随机引物或者特异性下游引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。本实验采用的逆转录酶是TaKaRa Reveese Transcriptase XL（AMV)。2. 扩增基因：-actin基因（Genbank登录号：NM_007393），编码-Actin，中文名叫做-肌动蛋白，是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。由于-actin基因被确认为一种“看家基因（house keeping gene）”，因而在很多western和RT-PCR实验中通常用来作为内参使用。-actin 引物序列：Sense primer: 5 CGGTCCACACCCGCCACCAGTTCG 3Anti-sense primer: 3CGTGGCGTTCACGAAGATCCGCCTG 53. 扩增产物的纯化：市面上所用的胶回收试剂盒，一般采用了特定具有吸附DNA能力的材料，可以有效地从反应混合物中分离出特异片段。本实验所用的试剂盒为E.Z.N.A Gel Extraction Kit，它采用凝胶融解系统先让含有DNA片段的凝胶融化，然后让DNA片段结于合DNA制备膜上，最后再用灭菌蒸馏水洗脱DNA。4. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度.琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系.因而就可依据DNA分子的大小使其分离.该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.溴化乙锭(EB)或EB替代物可与DNA分子形成EB-DNA复合物在紫外光照射下发射荧光,其荧光强度与DNA的含量成正比.据此可粗略估计样品DNA浓度.仪器与试剂1仪器：PCR仪、离心机、恒温水浴箱、电泳仪2. 试剂：MgCl2、10RT Buffer、RNase Free H2O、dNTP Mixture 、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、Oligo dT-Adaptor Primer、5PCR Buffer、dH2O、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq HS、上下游PCR引物（10pmol/L） 、凝胶回收试剂盒、TAE Buffer、电泳上样缓冲液、EB、DNA Marker 实验步骤1. RTPCR： A. 反转录反应1) 按下列组成配制反转录反应液，并混匀5RT Buffer 2LdNTP Mixture 4LRNase Inhibitor 0.5LAMV Reverse Transcriptase 1LOligo dT-Adaptor Primer 0.5L实验样品RNA 2L2) 按以下条件进行反转录反应。42 30min99 5min5 5min说明：Reverse Transcriptase能与cDNA结合，直接进行PCR反应有阻害作用。因此，PCR反应前，必须进行99、5分钟加热使Reverse Transcriptase失活。B. PCR反应1)按下列组成配制PCR反应液10PCR Buffer 5LddH2O 28LdNTP Mixture 4LTaKaRa Taq HS 1L上游PCR引物 1L下游PCR引物 1L2) 把上述共40L的反应液加入到A-2.反转录结束后的PCR反应管中轻轻混匀。3) 按以下条件进行PCR反应。94 2min 94 30sec30 Cycle61.5 30sec 72 1.5min72 7min4 2、琼脂糖凝胶电泳1）取30 mL TAE缓冲液加入三角瓶后，加0.3 g琼脂糖，使琼脂糖含量为1%(质量体积比)。 2）胶液的制备：将上述混合物放入微波炉或电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。待混合物冷却至50-60时，加入一定量的EB。 3）胶板的制备：将胶板置于胶槽内,插上样品梳子。然后将冷却好的混合物倒入胶槽中，倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。然后向槽内加入TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品孔中应注满缓冲液。 4）加样：所有样品（50L）与 10 L 6上样缓冲液混匀,小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染。注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5）电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。恒流，85mA,电泳至指示剂跑到胶的1/2处即可停止。6）紫外灯下看电泳结果。3. 扩增产物的纯化： 1）当所需DNA片段完全分离时，转移凝胶至紫外灯上，尽可能快地把所需的DNA片段切下来。注：切胶时尽量把多余的凝胶切去，DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。 2）将带有目的片段的凝胶块转移至1.5mL离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积。假设其密度为1g/mL（几乎所有DNA凝胶的密度都可以近似为1g/mL），凝胶块的体积可通过如下方法得到：凝胶薄片的重量为0.2g, 则其体积为0.2 mL。加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡或涡旋混合物。 注：在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果是橙色或红色，其pH值大于8，DNA的产量将大大减少。观察混和物的颜色，如果是橙色或红色，则要加入5L 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。 3）取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2mL收集管内（已备好）。 4）将第二步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管。 5）如果DNA/凝胶熔液的体积超过700L，一次只能转移700L至柱子中，余下的可继续重复第4步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25g DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。 6）弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管。转移300L Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。 7）弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管。转移700L SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000xg离心1min。 注意：浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。 8）重复用700L SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。9）弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。10）把柱子装在一个干凈的1.5mL离心管上，加入1530L（本次实验建议加入20 L）的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。 注意事项具体见实验步骤实验三 RT-PCR产物克隆实验目的1掌握DNA体外重组的原理与方法。2了解大肠杆菌氯化钙法制备感受态的原理，掌握制备的方法。3掌握大肠杆菌转化原理与方法。实验原理RT-PCR反应之后，Taq DNA聚合酶一般会在目的基因的3末端添加上一个A碱基，而T载体的3末端附带一个T碱基，扩增产物与T载体在连接酶的作用下，通过碱基互补配对作用，就可形成牢固的重组克隆载体。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。之后采用适当的方法使载体DNA分子进入受体细胞。本实验通过42热激、冰浴冷却的方法将外源DNA载体分子转化入宿主细胞内。仪器与试剂1 仪器移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程）恒温水浴锅（16），冰盒，超净工作台，培养箱，摇床，玻璃试管，离心机，玻璃棒。 2 试剂pMD19-T载体试剂盒，0.1M CaCl2。3 菌株与培养基大肠杆菌DH5；LB(Amp-)培养基，含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板。实验步骤1.PCR产物与T载体的连接（1）在洁净的0.2 ml的 Eppendorf管中依次加入下列各组分：实验组（每组做一个）： dd H2O 3 L Solution 5 L pMD19-T载体 1 L PCR产物 1 L 总体积 10 L对照组(一个班做一个，第五组同学做)： dd H2O 3 L Solution 5 L pMD19-T载体 1 L Control Insert 1 L 总体积 10 L（2）轻混反应物，并在16或者室温连接反应30分钟(时间可延长)。2.大肠杆菌感受态细胞的制备 （1） 接种10 L甘油菌至含有2ml LB培养基（Amp-）的试管中，37振荡培养过夜。注：前一步已经由实验中心老师准备好，同学们只需从下面第二步开始实验。（2） 以1%的接种量将甘油菌种30 L接种到3ml LB培养基（Amp-）中，37振荡培养3h(此时菌液的A600值达到0.30.4)；（示范操作）（3） 室温下，以5000rpm离心2min，回收细胞；（4） 在超净工作台里用枪头吸取上清弃掉，再用100L预冷的0.1M CaCl2 溶液重悬菌体（重悬时操作要轻），冰浴放置。 3.大肠杆菌的转化（无菌操作）（1） 将连接产物（试验组和对照组）加入到制备好的感受态细胞里，用加样枪反复吹打，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴10 min；（2） 42水浴热休克2 min，时间到后迅速在冰上冷却10 min；（3） 加入1mL LB培养基（Amp-），37静置0.51小时；（4） 5000rpm离心2min，在超净工作台中用枪头吸取800L上清弃掉，用剩余的液体将细胞悬浮；（5） 将悬浮细胞全部吸取并转移至含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，37倒置培养过夜。 注意事项：1、 吸取微量液体时务必要小心，确保将其全部转移到反应液中；2、 确保反应液混合均匀；3、 为提高转化率，要密切注意细胞的生长状态和密度。结果分析与讨论：若转化平板上未能长出菌落，说明转化失败，可能原因有：（1）与T-载体连接实验失败；（2）所制备感受态细胞质量差，重组载体未能成功转入；（3）进入宿主菌的外源载体分子未能表达。实验四 转化子的筛选及PCR鉴定实验目的1掌握蓝白斑筛选的基本原理及具体操作。2掌握常见的几种鉴定转化子DNA的方法，以及菌落PCR鉴定的原理和方法。实验原理现在使用的许多商业化质粒载体(如pUC系列和它们的衍生载体)都带有一段大肠杆菌DNA的短片段，其中含有-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它不破坏阅读框，而不影响其功能。这种类型的载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的片段都没有活性，但它们能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。这样，lacZ基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象称为互补。IPTG（异丙基-D-半乳糖苷）是一种乳糖类似物，可使lacI阻遏蛋白失活，从而诱导lac操纵子转录。由互补而产生的lac+细菌落易于识别，因为它们在生色底物X-gal存在的情况下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无互补能力的N端片段。因此，携带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验，大大简化了在这种构建质粒载体中鉴定重组子的工作，仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落，并识别可能含有重组质粒的菌落。这样的方法，即称为蓝白斑筛选法。选择性培养基上长出的菌落，由受体菌DH5的表型Amp-转变为Amp（由质粒提供抗性），且颜色为白色的菌落，证明重组质粒已转化入受体菌，但要证明插入片段的大小和序列，还需进一步鉴定。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。本实验将初筛得到的白斑菌落进行菌落PCR分析，观察PCR得到的DNA片段大小是否与预计的相符，从而对重组转化子DNA进一步鉴定。仪器与试剂1 仪器1.1 涂布器， 1个灭菌试管 若干超净工作台 1台空气浴水平摇床 1台电泳仪及配套电泳槽 1台紫外检测仪 1台1.2 移液器（200-1000 L） 1支 移液器（5-200 L） 1支移液器（0.5-10 L） 1支2 试剂2.1 LB（含Amp）液体培养基 15mL Amp的终浓度为0.1g/L（以1L LB/Amp液体培养基为例，Amp的含量为100mg。） 22配置1L LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基（举例说明）：终浓度 试剂 用量0.04mg/mL X-Gal 40mg0.024mg/mL IPTG 24mg1% (W/V) Tryptone 10g0.5% (W/V) Yeast Extract 5g1% (W/V) NaCl 10g0.1mg/mL Ampicillin 100mg1.5% (W/V) Agar 15g23 菌落PCR：PCR Buffer、dNTP mix、Primer 1# 、Primer 2#、 Taq DNA polymerase 、H2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、上样缓冲液、DNA染料实验步骤（以下操作均在超净工作台中进行）1蓝白斑平板的制作（此步已由实验准备老师完成，以下平板配置各试剂的剂量以1L为例进行说明）：（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone 10gYeast Extract 5gNaCl 10g（2）加入约800mL 的去离子水，充分搅拌混匀。（3）滴加5N NaOH(约0.2mL),调节PH值至7.0。（4）加去离子水将培养基定容至1L后，加入15g Agar。（5）高温高压灭菌后，冷却至60度左右。(6)加入1mL Ampicillin(100mg/mL)、1mL IPTG（24mg/mL）、2mL X-Gal （20 mg/mL）后均匀混合。(7) 铺制平板（30-35mL培养基/90mm培养皿）。(8) 4度避光保存,一般存放24小时后才开始使用。(9) 做转化液涂布平板操作时，提前1-2小时将平板从4度冰箱取出，室温避光温育，以待涂布使用。（10）见实验三中具体转化操作。（11）次日从37度温箱中取出平板观察，蓝色菌落即初步认定为未转化菌，白色菌落初步认定为转化子。2菌落PCR：（1）按顺序在PCR管中加入10X PCR Buffer 2L dNTP mix 1.6L Primer 1# 1 L Primer 2# 1 L Taq DNA polymerase 0.5Ldd H2O 13.9 L 总体积 20 L （2） 常温下随机挑选一个转化板上的转化子，用灭菌的小枪头挑取少量菌体；先将小枪头放入一支装有约3mL LB（Amp+）培养基的试管中洗涤2-3次，然后将同一枪头浸入装有PCR mixture的PCR管中反复吹打以作扩增培养细菌用；另取一PCR管，先进行操作（2）的操作，但不加转化子模板，作为阴性对照。将以上两个PCR管轻微离心后，放入PCR仪，设置反应程序：94 5 min 94 30sec30 Cycle61.5 30sec 72 1.5min72 7min4 （3） 取少量5L PCR反应产物，1%琼脂糖电泳分析。（4） 紫外检测仪下观察并记录扩增片段大小。 注意：电泳时需有标准DNA 分子量Marker和不加模板的阴性对照样品（5） 上述操作（2）中的洗涤过有菌枪头的试管，空气摇床37, 180-200rpm过夜（12-14hr）扩增培养，以备后续实验质粒提取及酶切使用。注意事项1互补筛选是非常可靠的，但并非永不出错：外源DNA的插入并不总是激活-半乳糖苷酶片段的互补活性。如果外源DNA很小（小于100bp），或者插入片段没有破坏编码框，也没有影响片段的结构，就可能不会严重影响互补。虽然这种现象在文献中有所报道，但是极为罕见，因此只对遇到这种问题的研究者才有意义。不是所有的白色克隆都携带重组质粒。Lac序列的突变或者丢失可能掩盖质粒表达片段的能力。2 PCR方法操作简便,但影响因素较多,欲得到好的反应结果,需根据不同的DNA模板,摸索最适条件。同时还要注意避免操作中每一步可能造成的人为污染。结果分析与讨论1LB/Amp/X-Gal/IPTG平板存放在4度避光的条件下，要使用时须提前1-2个小时取出，在室温下温育，以供涂布所用。2本次实验中所用的质粒为商品化的T载体pMD19-T,在实验过程中会注意到，它的颜色指示，将不如pUC19等质粒在蓝白斑筛选中的颜色指示明显。3挑取转化子菌落的时候，要注意挑取菌落的位置准确，沾取到平板上的些许琼脂不太会影响实验结果；用枪头在装有LB（Amp+）培养基的试管中上下2-3次即可，过分洗涤后，会造成PCR 反应模版不够，影响实验结果。先实验五 重组质粒提取与酶切鉴定实验原理用NaOH 和SDS破坏细菌包膜，并制造PH12.012.6的碱性环境，胞内容物释放出来后，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。当加入高盐的酸性乙酸钾溶液后，PH值调至中性，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心就可以除去大部分细胞碎片染色体DNA、RNA和蛋白质，质粒DNA尚在上清中，利用酚、氯仿、异丙醇、乙醇等试剂进一步纯化质粒DNA。核酸限制性内切酶是一类