牛乳中产耐高温蛋白酶嗜冷菌的分离.doc

牛乳中产耐高温蛋白酶嗜冷菌的分离及鉴定研究刘敏 曹志军 李艳梅（内蒙古农业大学职业技术学院014109）摘要：本文采用单一性底物平板分离法和Folin法，观察其水解圈大小和测酶活力，从牛乳中共获得10株产耐高温蛋白酶的嗜冷菌。对其菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化性状进行了系统研究, 鉴定结果表明,上述10个细菌菌株分别属于气单胞菌属（Aeromonas）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌属（Proteus）、节杆菌属（Arthrobacter）、短杆菌属（Brevibacterium）、微球菌属（Micrococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和明串球菌属（Trichococcus）。关键词: 嗜冷菌; 耐高温蛋白酶; 分离; 鉴定 Studies on Isolating of Identification of Psychrophilies Producing Thermotolerant Protease in Milk Liu min Caozhijun Liyanmei（Vocational and technical college of inner Mongolia agricultural university 014109） Abstract:Ten strains of Psychrophilies that producing heatproof protin enzymes were screened out by prate separation and folin methods. Meanwhile, it can also observe their proteclytic circle and proteclytic activity to obtain them.,and were idendified. as Aeromonas, Pasteurella, Flavobacterium, Proteus, Arthrobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Pediococcus, Lactococcus and Trichococcus based on bacterial modality,deying reaction, cultural characteristics, physiological characteristics and biochemical reactions.Key words: Psychrophilies; Heatproof protin enzyme; Isolation; Identification在低温条件下贮藏原料乳，会有嗜冷菌选择性的生长1。通常鲜乳中的嗜冷菌主要是由于榨乳用具不清洁和杀菌不彻底而污染所致，它在最初的细菌总数中占1050，在随后的冷藏过程中很快成为优势菌株，进行生长繁殖和代谢活动从而引起冷藏乳的变质。并且大多数嗜冷菌在低温贮藏时产生耐热性的胞外蛋白酶，这些酶类耐受高温处理，无法通过单一的加热方法将其灭活，使乳制品产生凝胶、沉淀、苦味、酸败等不良现象的同时影响产品的色泽。导致乳及乳制品风味和质地的变异，缩短保质期，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。目前，引起鲜乳变质的嗜冷菌（种属）国内外文献均有报道，但是对贮藏及加工过程中产耐热蛋白酶的嗜冷菌株未见报道。本文从牛乳中分离出产耐热蛋白酶的嗜冷菌株数株，对其进行培养及鉴定。为明确嗜冷菌的营养生理状况以及进一步探讨菌落对乳制品的影响奠定基础，对嗜冷菌在乳中的研究找到了立足点，为生产上有效控制嗜冷菌数量、减少其对乳的危害、提高乳品质量和安全性提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1乳样样品以蒙牛、伊利、内蒙古农业大学牧场的原料乳为研究对象。用灭菌吸头采样器采样2-3mL，带回实验室置4冰箱备用。1.1.2培养基LA培养基、NB培养基、PDA培养基、金氏培养基B(KB培养基)5。1.1.3标准菌株门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）AS1086购于中科院菌种保藏中心；1.2方法1.2.1产蛋白酶菌株分离方法：采用水解圈法初筛，应用管碟法和Folin试剂显色法进行复筛。1.2.2产酶菌株的鉴定：选取产酶菌株10株,将分离纯化的10个菌株在LA培养基上培养24h后,进行培养性状和生理生化测定,并按照格兰氏染色法和3%KOH简易法6,测定其染色反应;按照油镜观察和磷钨酸负染法电镜观察其菌体形态;同时将10个细菌菌株在0、5、10、15、20、25等6个不同的温度,5.5、6、6.5、7、7.5、8等6个不同氢离子浓度(pH值)和0.5%、3%、5%、7%、10%、15%等6个不同NaCl浓度条件下,接种培养不同时间,测定其生长情况。根据菌体形态、电镜观察、染色反应、培养性状和生理生化测定,并按伯杰氏细菌鉴定手册第八版等其他文献进行鉴定7-10。2结果2.1蛋白酶产生菌的筛选从乳中共筛选到嗜冷菌60余株，经水解圈法筛选得到产低温脂肪酶的菌株25株，应用管碟法和Folin试剂显色法进行复筛，发现只有10株菌株的酶活高于20 U.mL-1，因此对这10株菌进行鉴定。2.2菌体形态和培养性状鉴定结果表明:10个细菌菌株中有3个菌株呈格兰氏阴性反应, 7个菌株呈格兰氏阳性反应,10个菌株6个菌株为杆状，4个菌株为球状。将分离纯化的供试菌在NA和NB培养基上,15培养72h后观察记载,10个菌株在两种培养基各呈不同的表现(表1)。由表1可知,供试细菌菌株在GXY型智能光照培养箱和YQX型厌氧培养箱中培养72h,对氧气需求9号菌株兼性偏厌氧,其余菌均表现为好氧。从电镜下观察,1号菌株为周生鞭毛,4号菌株为端生鞭毛,其他菌株均无鞭毛。2.2供试细菌菌株生理性状供试细菌菌株在不同温度()、不同氢离子浓度(pH值)和不同NaCl浓度条件下,接种培养不同时间,观察检查记载结果(表2)。从表2可知,供试菌株在不同温度、不同pH值和不同NaCl浓度下培养,除1、3、7、8号菌株在0不生长，在0-25温度范围内10株菌均能生长。所有菌株在pH7.0-8.0、0.5%-5.0%NaCl条件下生长良好。2.3供试菌株生化性状对供试10个供试菌株生化性状测定,氧化酶等7种,6种氮素化合物和糖醇以及其他碳素化合物22种,其试验结果见表3。从表3试验结果可知,供试10个菌株,氧化酶10号菌株阳性,其他菌株均为阴性;过氧化氢酶阳性,肌醇阳性反应,除8号菌株不能利用鼠李糖,其他菌株均能利用17种糖类。同时10个菌株其他生化测定项目各异。2.4细菌菌株鉴定经对应检查菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应等各项指标鉴定,可知上述10个细菌菌株依次分别属于气单胞菌属（Aeromonas）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌属（Proteus）、节杆菌属（Arthrobacter）、短杆菌属（Brevibacterium）、微球菌属（Micrococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和明串球菌属（Trichococcus）。 表1 筛选菌落特征及革兰氏染色结果 Table1 characteristics of bacterial Screening and results of gram reaction菌株号菌体形状革兰氏染色反应鞭毛需氧情况菌落特征1杆状G-周生好氧淡白色圆形、表面光滑、边缘整齐、分泌水溶性色素2杆状G-无好氧橙色圆形、表面湿润、边缘缺刻状3杆状G-无好氧乳脂色圆形、表面光滑透明、边缘整齐4杆状G+端生好氧乳清色根状扩展、表面皱褶、边缘裂叶状5杆状G+无好氧乳清色圆形、表面光滑、边缘波状6杆状G+无好氧淡白色圆形、表面光滑、边缘不整齐7球状G+无好氧乳脂色不规则、表面波状皱褶、边缘缺刻状8球状G+无好氧淡白色圆形、菌落小、表面光滑、边缘整齐9球状G+无兼性厌氧淡白色圆形、菌落小、表面光滑、边缘整齐10球状G+无好氧乳脂色圆形、菌落小、表面光滑、边缘裂叶状1)+表示阳性;-表示阴性。 表2筛选菌落生理性状 Table2Physiologicalcharacteristicsofbacterial Screening1)+表示阳性;-表示阴性。 表3筛选细菌生化反应 Table3Biochemicalreactionsof bacterial Screening生化反应类型菌株12 345678910CK氧化酶+W+-+过氧化氢酶+-+-+苯丙氨酸脱氨酶+-色氨酸脱氨酶-+-+-赖氨酸脱羧酶+W-+-+精氨酸双水解酶+-+脲酶-+-+-脂酶+-+-硝酸盐还原+-+-+H2S产生-+-+-吲哚产生-+-V-V+甲基红(M.R)试验-+-+-V-V.P.试验-明胶液化+-+-+W+-+石蕊牛奶AlPePeAlPeSoPePeAlSoSo淀粉水解+-V-葡萄糖+-+W+-+蔗糖-+-V-+-乳糖-+-+-麦芽糖+-+纤维二糖+-V-+-+阿拉伯糖+-+-木糖-+-+-鼠李糖-海藻糖+-+-+棉籽糖-半乳糖-+-+果糖-+-+甘露糖+-+-+甘露醇+-+-山梨醇-+W-卫矛醇-肌醇-+-+-水杨素+-+七叶灵水解-+-+-丙二酸钠+-+-+-+柠檬酸钠-+-+琥珀酸钠-+-+-苹果酸钠+马尿酸钠-+-氨基乙酸+-+-注： +：阳性Postive； ：阴性Negative；+w：弱阳性Weak postive；v：可变的Variable； Re：还原Reduction；Pe：胨化Peptonigsation；Al：产碱Alkaline；So：凝固Solidify。3小结与讨论本研究从原料乳中共分离、纯化获得10个属的产耐高温蛋白酶的细菌菌株,分别属于气单胞菌属（Aeromonas）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌属（Proteus）、节杆菌属（Arthrobacter）、短杆菌属（Brevibacterium）、微球菌属（Micrococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和明串球菌属（Trichococcus）。由于实验条件的限制,本文只对同一地区来源原料乳进行了分离实验,而不同地区来源的原料乳会因食性和所生长的环境之间的不同,其存在的共生菌群也会存在较大的差距。因此,今后应进一步对以下内容进行深入研究:(1)继续系统分离和鉴定不同来源的原料乳中存在的微生物,测定数量结构,并进行比较研究;(2)利用分子生物学的方法,即16SrRNA技术对不同来源原料乳中的微生物分离及鉴定的细菌菌株作进一步的比较鉴定,从而更进一步明确原料乳地区分布微生物类群与寄主本身和环境条件之间的关系;明确地区乳中共生菌群与其生物学、生态学特性之间的密切关系,以及其在乳中协同进化中的重要意义。(3)要更好的了解蛋白降解菌株对乳制品及其它制品的危害机制，对菌株的最佳产酶时间及酶作用的最适酸碱度和温度，以及酶的其它特性有待进一步研究。只有对菌株产酶条件达到有效控制，才能为工业化生产中防止蛋白酶产生提供理论依据。(4)在分离过程中发现有许多产色素的菌属，可以考虑其对乳品色泽的影响，这将是新的研究热点。对研究低温贮藏食品中微生物种群和微生物地带的分布格局将有重要的意义。参考文献1胥伯强. 嗜冷菌对长货架期乳制品的影响. 食品安全与检测,262 Fell.Isolation and characterization of a mycobacterium species capable of degrading three and four aromatic and aliphatic hydrocar bons. Apple. Environ Microbiol, 1999, 65 (2): 549-5523 杨洁彬等编著. 食品微生物学. 北京:北京农业大学出版社，1989,125-1364 德庆主编. 微生物学实验手册. 上海：上海科学出版社，1986,109-1135 Stanier.R.Y,et al.J.Gen.microbial,1996,43:1596 王文仲编著. 应用微生物学现代生物技术. 哈尔滨：中国医药科技出版社，1996,200-2107 邱秀宝，赵前，刘辉等嗜盐性低温海洋细菌碱性蛋白酶的研究微生物学报，1990,17（5）：2802828 anner.A.C. microbes in extrent