微卫星引物筛选步骤.doc

1进行酶切用Vsp对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。反应体系为：ddH2O 15L Vspbuffer 2L Vsp酶 1L DNA 2L 总体积 20L酶切在37反应34h即可，但是为了提高酶切效率可切46h。PCR反应程序为：94 5min，（94 1min，53 1min，72 1min）30，72 10min，4 hold。Vsp酶即（Ase酶）：酶切识别位点为：5A TT A A T 3 5T A A TT A 3Ase酶的接头为：A1：5CTC GTA GAC TGC GTA CC 3A2：5TAG GTA CGC AGT C 3 Ase酶用的预扩增产物为：A3：5CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 32接头制备用10L A1（200M）和10L A2（200M）混合，94 3min后室温放置30min。3酶切片段与接头连接 接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下： ddH2O 5L T4 ligation酶 0.5L T4 buffer 4L 酶切产物 20L ATP（10mM） 0.3L AE 1L总体积 30.8L 上述混合体系在16连接过夜。10h左右。4连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下： ddH2O 14L 10buffer 2.5L Mg2 2L dNTPs（10mM） 0.5L A3 1L DNA（连接产物） 5LTaqE（2.5U/L） 0.2L总体积 25.2L PCR反应程序为：（94 30sec，56 1min，72 1min）20，72 10min，4 hold。5.检测扩增产物 扩增产物大小应在750bp左右，即4001000bp较好。6回收扩增产物将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中向其中加入1/10总体积预冷的3M NaAC和2倍体积预冷的无水乙醇（或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇）20放置30min（该步可在20长期保存） 室温，12000rpm离心10min弃上清，加入1ml左右70乙醇洗涤一次 室温，12000rpm离心5min弃上清，干燥后加入20LddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）7配杂交体系取250500ng回收DNA与5080pmol bio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分别为4.2SSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下：ddH2O 74.5L 20SCC 21L 10%SDS 0.7L 回收产物 3L bio-SSR探针（AC）15 0.8L 总体积 100LPCR反应程序为：95 5min，在58可以保存，但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。bio-SSR探针序列可以为（AC）10、（AC）15、（AC）12或者AG重复均可，这个可以根据基因组序列确定。8磁珠准备1）2mg beads（200L）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100200L之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一侧，然后从另一侧吸弃清液，再加入1mLTEN100洗涤，轻柔颠倒混匀，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反复3次即可。2）用40LTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3）为减少特异性吸附向上述混合液中加入2L与之无关的基因组DNA（如植物基因组）。9吸附1）将杂交体系与稀释的磁珠混合，再加入200LTEN100稀释。2）室温放置30min，期间轻柔混合（不能用力过猛，因为该过程是目的片段与探针吸附）。10洗涤(去掉多余DNA和杂质)将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。1）松弛型洗涤：400LTEN1000洗涤3次，每次5min，加入TEN1000后轻柔混匀。2）严谨型洗涤：12L20SSC12L10SDS1176LddH2O，400L/次，洗涤3次，每次5min，其间需轻柔混匀。（使SSC终浓度为20，SDS为0.1%）。11洗脱1）第一次洗脱：在磁力架上弃上清液，向磁珠中加入50LTE，95 5min后迅速取出将上清液吸入另一个管子中（若温度降低那么则会复性），放入20保存。2）第二次洗脱：向第一次洗脱后的磁珠中加入12L 0.15M NaOH,洗脱20min后，将其放在磁力架上，取一侧清液，向清液中加入1.8L 1M HCL，再加入36.2LTE，总共50L后，放入20保存。3）洗脱产物回收：分别对两次洗脱后的产物进行回收。分别向两次洗脱后的产物加2LYtRNA，50L预冷的4M NH4Ac以及100L预冷的异丙醇，放入20 30min以上（也可以长时间保存）。然后12000rpm离心10min后弃上清，（应特别注意因为几乎看不到沉淀，所以注意小心将弄丢），再加入70乙醇洗涤一次，再12000rpm离心5min，弃上清。4）将沉淀干燥后溶于20LddH2O中。12扩增洗脱后回收的产物 扩增上一步中的回收产物，NL1st，NL2nd；GS1st和GS2nd各扩增4管。PCR反应体系为：ddH2O 13.6L 10buffer 2L Mg2 1.2L dNTPs（10mM） 0.4L A3 0.8L DNA（回收产物） 2LTaqE（2.5U/L） 0.2L总体积 20L PCR反应程序为：94 5min，（94 1min，53 1min，72 1min）30，72 10min，4 hold。检测扩增产物，最好在750bp左右，即4001000bp均可。13回收PCR扩增产物将所扩增的有目的带的产物加入到一个EP管中，加入总体积1/10体积的3M NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇（也可以用等体积4M NH4Ac和2倍体积的预冷异丙醇，但是NH4Ac会去掉小片段，而NaAc不会），20放置30min以上室温，12000rpm离心10min弃上清，加入1ml左右70乙醇洗涤一次 室温，12000rpm离心5min弃上清，烘干后，沉淀溶于20LddH2O中。14与载体连接在EP管中配制连接混合液，总体积为10L。PMD18-T Vector 0.5L Insert DNA 1L ddH2O 3.5L Ligation Solution 5L 总体积 10L上述混合液在16连接过夜。其中，PMD18-T Vector用0.51L均可，Insert DNA在0.10.3pmol，一般加入1L，这些都根据DNA的量确定。Ligation Solution应在冰上溶解。15连接产物的回收 取出连接产物，向10L反应体系中加入2LYtRNA12L预冷的4M NH4Ac24L预冷异丙醇，混匀后20沉降30min以上。（YtRNA的作用是帮助沉淀，因为连接产物较少所以要加入助沉剂YtRNA）室温，12000rpm离心10min弃上清，加入500L（根据DNA量多少加）70乙醇洗涤一次 室温，12000rpm离心5min弃上清，烘干后，沉淀溶于5LddH2O中。16电转化电转化杯和电转化细胞在冰上预冷。1向每管连接产物回收液中加入50L电转化细胞，用枪混匀放在冰上。2把混合液加入电转化小杯中心的孔隙中，放到冰上。3用纸擦干小杯，用1500V电压在电转化仪上进行电击（电击时间长短是根据DNA量确定的，机器自己会控制）。4转化后，每个小杯中加入900L液体LB（不加氨苄），用枪头吹打以便使其和转化细胞混匀。5取出所有液体加入1.5mLEP管中，170rpm，37摇1h。6清洗电转化小杯，避免接触金属面，分别用ddH2O，70乙醇和无水乙醇各清洗3次。7取出摇好的菌液后，适当稀释涂板，30L菌液370L液体LB，然后涂2个板子，每个板子200L。在37培养过夜。接头序列：ATTAGGTACGCAGTCTACGAGCTCGTAGACTGCGTACCTAAT5B：AATGGGAAAGGCACAACTACAAGTCCCAGAATGCAAAGTGCTGTTGGCTAAAAAGCCAGGATTGGCTGAAGGTGTCACACATGACATGGGGCCACTTGGCAGTTATGCACAGCTCCGAAAAGGGCTTTTGGTGCCAAGGATGGGTATTCCTCTGAGAACATTTGTGCCTGAATTTTGGCGAAAAGTACCCCTGGTCAGAGCTACAGAGCTGGTGTGTGAACTGCCCTGGTGAACGTTTCATCTCTACTCTGCACCACATAGTGGCTGGGGTTTTCCCCACACTTTTTACTCAGTGCAACATTAGCCTTGTGATTTGTTTTTCTCAGTAGTGTAAAAACACAGTTCTTCAGATTCCAGGTTGCTTCACTTGTGGTTGTTCCTCTGCTCCCTGGTGACTTTGCTTAGAAGCTCCAGTATTACAAAGATTGTACATGCACCTCTAATCTAGCCCTCTTTGTTCCTCTACTGATGTTTTTCTGTTGGTGTCTCACTTGATCTGTCTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATCACTCTCTTTCTCCAGCATCA