离体蟾蜍心脏灌流.doc

离体蟾蜍心脏灌流【摘要】将蟾蜍的心脏完整离体，插入挖心套管，分别用氯化钠，氯化钾，氯化钙，肾上腺素和乙酰胆碱处理，可观察到不同药物对心脏的影响。氯化钠，氯化钾与乙酰胆碱均使心搏减弱，氯化钙与肾上腺素能加强心脏收缩力和心率。【实验材料】动物：中华蟾蜍试剂：5%氯化钠溶液；1%氯化钾溶液，2%氯化钙，任氏液（Ringers solution），1：100000肾上腺素溶液，1：100000乙酰胆碱溶液，任氏液器材：蛙类手术器械，BL420E+生物机能分析系统，张力换能器，蛙心套管，试管夹，滑轮（杠杆）【实验内容】1. 离体蟾蜍心脏的制备(1)取一蟾蜍毁其脑和脊髓，仰位固定于蛙板上，暴露心脏。(2)心脏插管 分支前的主动脉下穿一线并打一松结备用 ，左侧主动脉穿一根线并结扎之，用左手提起结扎线，右手用眼科剪在左侧主动脉距分叉部3mm处剪一“V”型口。将盛有少量任氏液的蛙心套管(用拇指将套管堵住，以防套管中的任氏液流出)从“V”型口插入动脉球底部，然后稍后撤套管，再转向心室中央方向插入，可见液面随心搏升降即可。将分支前主动脉下的松结扎紧，并固定在套管的小突上。小心提起套管和心脏，剪断主动脉左右分支；结扎与静脉窦相连的后腔静脉，并在结扎线以下剪断，将心脏摘出。2.观察项目(1)开启系统，描计一段正常心搏曲线。注意观察心跳频率和强度以及心脏的收缩、舒张程度。(2)向蛙心套管内滴加5%NaCl溶液，观察心跳变化。(3任氏液洗脱，待心跳恢复，加入2%氯化钙溶液12滴，观察心跳变化。(4)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1%氯化钾溶液12滴，观察心跳变化。(5)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1:100000肾上腺素溶液23滴，观察心跳变化。(6)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1:100000乙酰胆碱溶液12滴，观察心跳变化。【实验结果】加入各种药品后心脏心搏曲线变化如图所示图一：NaCl对心脏的影响图二：Kcl对心脏的影响图三：CaCl2对心脏的影响图四：肾上腺素对心脏的影响图五：乙酰胆碱对心脏的影响【实验讨论】1、滴加氯化钠溶液，心跳显著减弱。心肌细胞的收缩对细胞外的浓度有很高的依赖性，因其是触发心肌质网释放的关键。当在任氏液中滴加氯化钠时，Na+与内流的竞争性抑制导致内流减少，心肌的收缩活动也随之减弱。若细胞外离子浓度低至接近零时，虽然心肌细胞仍能产生动作电位，但没有 的内流，不能引起收缩。即“兴奋-收缩脱耦联”。2、滴加氯化钾溶液后，心跳减弱至停止本实验所用的氯化钾浓度对于蟾蜍体液来讲属于较高浓度，而细胞外K+浓度较高时K+与 有竞争性拮抗作用，K+可抑制细胞膜对的转运，使进人细胞内减少，心肌的兴奋一收缩耦联过程减弱心肌收缩力降低。且当细胞外K+浓度较高时，膜内外的K+浓度梯度减小，静息电位的绝对值过度减少，Na+通道失活，心肌的兴奋性完全丧失，心肌不能兴奋和收缩，停止于舒张状态。此时，仅由 来构成动作电位，钙通道激活慢，因此去极化上升幅度小而缓慢，使兴奋传导性降低。而当K+浓度增高值不大时，由于膜对K+的通透性较大，静息电位主要由细胞内外K+浓度差决定，当K+浓度稍升高时，静息电位升高，与阈电位差值减小，使细胞兴奋性增加。当细胞外K+浓度升高时,细胞膜对钾的通透性升高,心室肌细胞复极过程加速,平台期缩短,不应期也缩短。均能增加工作细胞的收缩舒张速率。3、 滴加氯化钙溶液中，离体蛙心收缩力显著增强首先浓度上升，内流增加，导致心肌质网释放量增加，使心肌收缩力增强。内流是慢反应细胞（如窦房结P细胞）0期去极化和快反应细胞（工作细胞）2期的主要离子活动.当细胞外浓度升高时，内流加快,慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性升高。当肌浆中的浓度不断升高，与肌钙蛋白结合数量不断增加，甚至达到只结合不解离的程度，于是，心肌将会处于持续收缩状态，称为“钙僵”。但同时，浓度上升，与Na+内流竞争性抑制作用使得Na+内流降低，从而触发Na+快速内流产生0期去极化就比较困难,使阈电位上升，与静息电位的差距增大，兴奋性降低。发生兴奋后，Na+内流的抑制则导致0期去极化速度和幅度降低,传导性下降。4、滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强在心肌细胞起作用的主要是去甲肾上腺素。去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的肾上腺素受体结合,激活腺苷酸环化酶(AC),使细胞内cAMP浓度升高,激活PKA和细胞内的蛋白质磷酸化过程,使心肌细胞膜上的钙通道激活，动作电位平台期Ca2+内流增加，心肌收缩力增强。另外去甲肾上腺素能加强4期的内向电流If,对浦肯野细胞影响较大，使心率加快。另外，肾上腺素还能降低肌钙蛋白与亲和力，促使肌钙蛋白对的释放速率增加，导致了心肌细胞收缩能力的增强。肾上腺素也能提高肌浆网膜摄取的速度，刺激Na+ 交换使复极期向细胞外排出的作用加速。提高了工作细胞的收缩舒张速率，因此不会出现钙僵，收缩是完全的。5、滴加乙酰胆碱后，蛙心活动减弱滴加乙酰胆碱后，强见蛙心收缩减弱，心率减慢。最后，心跳停止于舒张阶段。乙酰胆碱可与心肌细胞M受体结合，能提高心肌细胞膜钾离子通道的通透性，促使钾离子外流，对窦房结细胞来讲，复极时钾离子外流增多，最大复极电位绝对值增加，Ik衰减过程减弱，自动去极化速度减慢。导致窦房结自律性降低，心率减慢。（2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，钙离子进入细胞内减少，使心肌收缩力减弱乙酰胆碱还能直接抑制钙离子通道，减少钙离子内流，使心肌细胞收缩减弱。6.心脏收缩主要与前负荷，后负荷以及心肌细胞收缩能力有关，因此凡是影响以上活动的因素均能影响心脏收缩力。（1）前负荷：前负荷主要取决于心室舒张末期容积，而其与心室舒张末期压力在一定范围内有良好的相关性，因此可用心室舒张末期压力来反映。对于离体的蟾蜍心脏，其心室舒张末期压力主要取决与灌流液柱产生的压力，因此灌流时每次液面的高度要保持一致，以保证其前负荷的相对稳定。本次试验中会出现换液前后正常的心搏曲线其收缩力不一致，可能就是受液面高度不一致的影响。心肌细胞通过异长调节对搏出量进行精细、小幅度的调整，使心室射血量与静脉回心血量保持平衡，以适应静脉回流的变化。在实验过程中，可能会涉及离体蟾蜍心脏的异长调节，但是由于灌流液体量的影响可能已经超出异长调节所及范围，因而其效果并不明显。（2） 后负荷：对于心脏来讲，大动脉血压是心室收缩时的后负荷。对于离体的蟾蜍心脏，后负荷实际也取决于灌流液面压强，因为心室要将液体泵出，克服的就是灌流液产生的压力。这也说明保持灌流液面一定高度的重要性。（3） 心肌收缩能力：对心肌来讲，凡是能影响兴奋-收缩耦联过程中各个环节的因素都可以影响收缩能力。其中霍华德横桥数目和肌球蛋白头部ATP酶的活性是影响心肌收缩能力的主要环节。活化横桥数目的多少取决于兴奋时胞质内浓度和肌钙蛋白对的亲和力。因此，当增加细胞外浓度时，内流增加，触发肌质网钙释放增加，可以增加心肌活化横桥数目，使心肌收缩能力加强。肾上腺素或去甲肾上腺素在激动心肌细胞的肾上腺素能受体后，可通过cAMP转到途径，激活细胞膜上的L型钙通道，是 内流增加，从而达到与增加 浓度相同的效应。（4） 凡是能影响细胞内浓度的因素，均能影响心肌的收缩性。如细胞外浓度增加，肾上腺素导致的内流增加，Na+或K+导致的细胞外内流减少，乙酰胆碱增加K+外流缩短2,3期，抑制钙通道开放导致内流减少，其实质都是影响了心肌细胞内肌质网的释放而影响心肌的收缩性。7. 心脏功能另一个重要的衡量参数是心率。心率主要决定于心脏起搏点的自律性。主要取决于自