拟南芥种植及处理基本方法

实用文档1 培养基 MS培养基（Sigma公司） B5培养基（pH 5.5） Content mg/L Content mg/L Content mg/LKNO32500 ZnSO4.7H2O 2.0 Nicotinic 1 CaCl2.2H2O 150 H3BO3 3.0 Thiamine HCl 10 MgSO4.7H2O250 KI 0.75 Pyrindoxine 1 NaH2PO4.H2O150 Na2MoO4.2H2O0.25 m-Inositol 100 FeSO4.7H2O 27.8 CoCl2.6H2O 0.025 Glycine 200 MnSO4.H2O 10 Na2EDTA 37.3 Kinetin 0.1 CuSO4.5H2O0.025 IAA0.1-1改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）： Content mM Content mM KNO31.25 ZnSO40.002 Ca(NO3)21.50 H3BO30.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO40.5 (NH4)6Mo7O240.075 FeSO40.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2 植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 oC，16/8 h的光照培养间中生长。 3 拟南芥种子的表面灭菌处理1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。4）将种子用15% Bleach （KAO公司） 处理15分钟，间歇振荡。5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。4 植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上， 10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。 5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法到网站/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RPT-DNA LB： LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LPRP，BPRP扩增基因组DNA。方法：1) 将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。2) DNA提取缓冲液的配制：成分终浓度Tris-HCl (pH 8.0)10 mMEDTA-Na2312.5 mMSLS （月桂酰肌氨酸钠）1 %PVPP （polyvinylpolypyrollidone）1 %3) 剪取一片叶于1.5 ml Eppendorf管中，液氮充分研磨。4) 加40 ml 提取缓冲液，涡旋充分混匀。5) 95中水浴20分钟，间或混匀几次。6) 12,000 rpm离心15分钟。7) 吸取上清于一新的Eppendorf管，取10 ml稀释50倍。然后取稀释后的DNA用于PCR扩增。PCR扩增体系为（25 ml体系）：模板1 mlrTaq0.2 ml10rTaq buffer2.5 mldNTP(2.5 mM)2 mlLP或L