镍铬合金烤瓷修复体拆除前后患牙龈下菌群的变化.doc

www.CRTER.org郭大伟，等. 镍铬合金烤瓷修复体拆除前后患牙龈下菌群的变化镍铬合金烤瓷修复体拆除前后患牙龈下菌群的变化郭大伟1，宋 玲1，张春艳1，曹 阳1, 李菁文2，梁 星2 (1青岛市市立医院口腔科，山东省青岛市 266071；2四川大学华西口腔医院修复科，四川省成都市 610041)文章亮点：实验创新性的将变性梯度凝胶电泳技术引入到镍铬合金烤瓷修复体对龈下菌群影响的研究中，通过龈下全细菌DNA图谱分析，摆脱了细菌培养、鉴定工作的繁琐，同时又能够更全面、动态的观察龈下菌群的组成和变化情况。关键词：生物材料；组织工程口腔材料；变性梯度凝胶电泳；镍铬合金；金属烤瓷；龈下菌群；16S rRNA；牙周可疑致病菌；牙周炎；镍离子；铬离子；牙周损伤主题词：生物相容性材料；铬合金；金属烤瓷合金；牙周炎基金资助：青岛市科技计划基础研究项目(12-1-4-16-(8)-jch)*；青岛市卫生科技计划项目(2012-WSZD005)*；青岛市市立医院“总院长科研专项基金”项目(ZYZJJ-2013- W020-配)*摘要背景：目前有关镍铬合金烤瓷修复体对龈下菌群影响的研究还较少。目的：探讨镍铬合金烤瓷修复体对龈下菌群构成比的影响。方法：选择因怀疑镍铬合金烤瓷修复体影响健康而要求拆除原修复体的烤瓷牙患者9例(患牙12颗)，于镍铬合金烤瓷烤瓷修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月时，采用变性梯度凝胶电泳法检测镍铬合金烤瓷修复体基牙及对侧同名天然牙的龈下菌斑。结果与结论：修复体拆除后1，3个月，患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图谱与拆除前相比均发生了明显变化，而且拆后3个月与拆后1个月相比也发生了较明显变化；此外，选择在修复体拆除前龈下菌斑中经常出现而在拆除后消失或减弱的变性梯度凝胶电泳图像中一些特异性条带作16S rDNA片段的序列分析，结果显示这些特异条带的基因序列分别与啮蚀艾肯菌、直形弯曲菌和隐藏优杆菌有着较高的序列相似度。结果表明镍铬合金烤瓷修复体导致了修复基牙龈下菌群组成的变化，并且导致了部分牙周可疑致病菌构成比增加。Variation in subgingival flora of abutments before and after removal of nickel-chromium alloy porcelain-fused-to-metal restoration Guo Da-wei1, Song Ling1, Zhang Chun-yan1, Cao Yang1, Li Jing-wen2, Liang Xing2 (1Department of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 2Department of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China)郭大伟，男，1974年生，山东省苍山县人，汉族，2010年四川大学毕业，博士，主治医师，副教授，硕士生导师，主要从事口腔修复学及种植学的临床和应用基础研究。dawei_ 通讯作者：梁星，主任医师，教授，博士生导师，四川大学华西口腔医院修复科，四川省成都市 610041 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)51-08834-07修回日期：2013-09-13(201305045/GWW)Guo Da-wei, M.D., Attending physician, Associate professor, Masters supervisor, Department of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, Shandong Province, Chinadawei_Corresponding author: Liang Xing, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, CAccepted: 2013-09-13AbstractBACKGROUND: Currently, there are few reports on the effect of nickel-chromium (Ni-Cr) alloy porcelain-fused-to-metal (PFM) restoration on subgingival flora of abutment.OBJECTIVE: To investigate the effect of the Ni-Cr alloy PFM restoration on subgingival flora ratio of abutment.METHODS: Nine patients (12 teeth) who suspected that Ni-Cr alloy PFM could affect their health and therefore came to hospital to ask for removal of the prosthesis were selected in this study. Their subgingival plaques of abutment were obtained before and 1 month, 3 months after the Ni-Cr alloy PFM restorations were removed, respectively, and the changes of subgingival flora were observed and analyzed by the method of denaturing gradient gel electrophoresis. RESULTS AND CONCLUSION: The images of denaturing gradient gel electrophoresis in subgingival bacteria of experimental group had significant changes at 1 and 3 months after Ni-Cr alloy PFM restorations removed, furthermore, there were significant differences in the images of denaturing gradient gel electrophoresis at 1 and 3 months. In addition, the specific bands were selected from denaturing gradient gel electrophoresis image that appeared before Ni-Cr alloy PFM restorations removed and weakened or disappeared after the removal of restorations, then 16S rDNA sequence in the specific bands were analyzed. The results showed that the gene sequences of these bands were closest related to Eikenella corrodens, Campylobacter rectus and Eubacterium saphenu. These findings indicated that the Ni-Cr alloy PFM restorations would result in the changes of the 8835 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 proportion of subgingival microflora and increases in the detection rates of some periodontal pathogens.Subject headings: biocompatible materials; chromium alloys; metal ceramic alloys; periodontitisFunding: the Basic Research Program of Qingdao Scientific Plan, No. 12-1-4-16-(8)-jch*; the Health Scientific Plan of Qingdao City, No. 2012-WSZD005*; Deans Specific Fund of Qingdao Municipal Hospital, No. ZYZJJ-2013- W020-pei*Guo DW, Song L, Zhang CY, Cao Y, Li JW, Liang X. Variation in subgingival flora of abutments before and after removal of nickel-chromium alloy porcelain-fused-to-metal restoration. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(51): 8834-8840.8839ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction镍铬合金烤瓷修复体因其价格低廉、性能良好被广泛应用于国内口腔临床。但随着其应用的普及也暴露了一系列不容忽视的弊病，如牙龈增生、红肿和修复体边缘牙龈色素沉着等1。目前一般认为镍铬合金烤瓷修复体导致的局部牙周炎症与释放的金属离子直接相关1-3，但尚无确切证据阐明损伤的机制。现已公认牙周病是由龈下细菌引起的慢性疾病，因此牙龈或牙周的炎症必然与龈下菌群的变化相关，然而关于镍铬合金烤瓷修复体对龈下菌群的影响的研究目前还较少报道。变性梯度凝胶电泳是用来检测DNA片段中单个碱基改变的点突变的一种电泳技术，自1993年Muyzer等4引入微生态的研究后，现已作为比较微生物群落多样性和监测群体动态的一个重要分子学工具5-7。实验创新性地引入此技术来观察镍铬合金烤瓷修复体拆除前后患者修复体基牙龈下菌群的组成变化，以探讨修复体对龈下菌群的影响。1 对象和方法 Subjects and methods设计：前后对照观察。时间及地点：实验于2011年3月至2012年9月在青岛市常见病重点实验室完成。对象：选择来青岛市立医院口腔科及四川大学华西口腔医院修复科就诊，因怀疑修复体镍铬元素影响健康而要求拆除原镍铬合金烤瓷修复体的9例患者(患牙12颗)作为研究对象，其中单颗烤瓷牙修复患者6例，2颗烤瓷牙修复患者3例；男性3例，女性6例；年龄26-60岁，平均(41.4410.17)岁。纳入标准：患者半年内未用对微量元素代谢有影响的药物，居住地区无明显环境污染，无镍铬金属职业接触史。修复体所在的实验牙牙位限制在上颌一侧前牙和双尖牙区，要求为1个或2个单冠，修复体边缘深入龈下0.5-1.0 mm，无明显悬突，边缘密合度良好。口腔卫生良好，无明显牙周疾病者。咬合关系基本正常者。实验牙的对侧同名牙为健康天然牙。修复体拆除前半年内以及拆除后的实验期间未行牙周治疗者。近3个月内未服用抗生素及免疫制剂者。女性患者未妊娠。无系统性疾病，依从性好者。镍铬合金烤瓷修复体拆除前后患牙龈下菌群变化实验的主要仪器和试剂：Sanyo公司，日本上海青浦沪西仪器厂Beckman Coulter公司，美国Perkin Elmer公司，美国UVP公司，美国Bio-Rad公司，美国北京索莱宝科技有限公司Promega公司，美国大连TaKaRa公司Sigma公司，美国来源低温冰箱漩涡混合器台式高速离心机紫外分光光度仪、PCR扩增仪、ABI PRISM 377 DNA自动测序仪、ABI PRISM BigDye 引物测序试剂盒紫外交联仪电泳仪、Dcode通用突变检测仪、Quantity One 4.3.0图像处理软件 CTAB裂解液(100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，100 mmo/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4， 1.5 mol/L NaCl，2%CTAB， 0.01 g/mL PVP)、溶菌酶、DNA胶回收试剂盒蛋白酶KPCR扩增试剂盒、pMD18-T载体试剂盒丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺、TAE 缓冲液(0.04 mol/L Tris碱， 0.02 mol/L 乙酸和1.0 mmol/L EDTA，pH 7.5、TEMED)、过硫酸胺、去离子甲酞胺、尿素试剂及仪器方法：采用自身前后对照及对侧同名天然牙对照的方法，于镍铬合金烤瓷烤瓷修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月取龈下菌斑，每次所取龈下菌斑予以编号，1-12为取样患牙编号，A、B、C和D则分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后个3个月和对照组，修复体拆除前后所取所有样本同时采用变性梯度凝胶电泳法进行比较分析。龈下菌斑的采集：选择烤瓷修复体基牙和对侧同名牙唇舌(腭)侧近远中轴面角处为取样区(4个位点/牙)，无菌纸尖放置20 s后取出，置于盛有1 mL PBS的无菌Eppendorf管中，在涡旋混合器上两次振荡30 s，然后将纸尖取出，置冰箱-70 待检。龈下菌斑DNA的提取：采用CTAB法提取龈下菌斑全细菌DNA8-9。取出细菌标本，室温解冻，低温离心 5 min (4 ，12 000 r/min)，留沉淀物。将1.5 mL 2% CTAB裂解液加入到有细菌沉淀物的Eppendorf管中，振荡混匀，然后加入20 L溶菌酶(100 g/L)和30 L蛋白酶K(1 g/L)，37 温度下，200 r/min振摇40 min，65 水浴30 min。然后室温下冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇(241)，抽提2次，12 000 r/min离心15 min。收集上层清液到另一个新管中，加入0.1倍体积的3 mol/L醋酸钠和0.6倍体积的异丙醇，-20 温度下放置 30 min，然后4 温度下8 000 r/min离心10 min，弃去上清液。沉淀物用500 L 体积分数70%乙醇清洗2次，最后一次离心(4 ，8 000 r/min) 10 min后，移去上清液，自然挥干，将DNA沉淀溶于50 L去离子水中，置-20 冰箱保存。DNA纯度及浓度测定：紫外分光光度仪分别测量DNA在260 nm和280 nm处吸光率(A值)，样品DNA在260 nm和280 nm处的光吸收比值A260/A280在1.7-2.0的范围内，表示DNA纯度较好。聚合酶链反应技术扩增龈下菌斑全细菌16S rDNA序列：采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术，引物设计含GC夹的16S rDNA通用引物扩增全细菌16S rDNA序列。正向引物(含一40 bp GC夹)：5-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC -3；反向引物：5- CGG TGT GTA CAA GAC CC -3。引物对应E.coli 16S rDNA序列上968-1401的核苷酸位置433 bp。采用TaKaRa公司的PCR扩增试剂盒，PCR扩增仪上进行扩增，扩增反应体系：DNA模板 2 L，10PCR buffer 2.5 L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 L，2.5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 L，20 mol/L正向引物0.5 L，20 mol/L反向引物 0.5 L，去离子水17.25 L，合计25 L。PCR反应条件：预变性94 5 min，变性94 30 s，退火65 45 s，延伸72 1 min，30个循环后，72 充分延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶(0.5 mg/L溴化乙锭)进行电泳。PCR产物的变性梯度凝胶电泳：采用Dcode通用突变检测仪对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳。电泳采用80 g/L聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/双丙烯酰 胺=37.51)，凝胶变性梯度为30%-70%(100%变性剂为7 mol/L尿素和体积分数40%甲酰胺)，变性剂浓度沿电泳方向由低到高。变性梯度胶完全凝固后，将胶板放入装有1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR产物15 L加入加样孔中，在电压200 V和温度60 的状况下电泳3 h。电泳后，凝胶用硝酸银染色，并拍摄照片。变性梯度凝胶电泳图谱分析：变性梯度凝胶电泳图像采用Quantity One 4.3.0图像处理软件进行分析。分析方法采用Gillan等10和Zijnge等11建议的方法，以每个泳道的条带数来评价微生物多样性，用相似系数(coefficient of similarity，Cs)来比较两个微生物群的种群关系，计算公式如下：Cs2j/(a+b)100%，其中j是指变性梯度凝胶电泳两个泳道共同条带的数目，a是指其中一条泳道的条带数，b为另一条泳道的条带数变性梯度凝胶中特异性16S rDNA片段的基因序列分析：选择变性梯度凝胶电泳凝胶上特异性的DNA条带，用无菌手术刀片切下该条带，然后用1PCR缓冲溶液40 L洗涤2次，再用枪头捣碎，用1PCR缓冲溶液40 L浸泡，4 过夜。取过夜浸泡液5 L，以其中的DNA片段作模板按前面所述的方法进行PCR扩增，PCR扩增产物用DNA胶回收试剂盒纯化。纯化后的PCR扩增产物用pMD18-T载体试剂盒进行克隆，插入的DNA片段采用ABI PRISM BigDye 引物测序试剂盒以及自动DNA测序仪进行测序。测得的基因序列通过BLAST工具搜索基因库(GenBank)中的序列同源性。主要观察指标：修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月患牙龈下菌群的构成比。 2 结果 Results2.1 参与者数量分析 纳入符合试验标准的患者9例共12颗患牙，按意向性处理分析，全部进入结果分析。2.2 修复体拆除前后患牙龈下菌群的变性梯度凝胶电泳图谱的变化 修复体拆除前后12颗患牙及对侧同名牙的龈下菌斑变性梯度凝胶电泳图谱，见图1-4。1 2 3A B C D A B C D A B C D注：A、B、C和D分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月和对侧同名天然牙。变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化，但条带的强度和位置出现了较明显变化。1号患牙A泳道上黑色箭头所示的条带在B、C、D泳道上均明显减弱，而且在其他患牙的变性梯度凝胶电泳图像上也基本没有出现或较弱，2号A泳道上黑色箭头所示的条带在3号患牙的A泳道上同一位置出现，而在B、C、D泳道均消失或减弱。图1 编号1-3患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像Figure 1 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of subgingival plaque in abutments 1-3A B C D A B C D A B C D4 5 6注：A、B、C和D分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月和对侧同名天然牙。变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化，但条带的强度和位置则出现了较明显变化。图2 编号4-6患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像Figure 2 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of subgingival plaque in abutments 4-67 8 9A B C D A B C D A B C D注：A、B、C和D分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月和对侧同名天然牙。变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化，但条带的强度和位置则出现了较明显变化。8号A泳道黑色箭头所示条带在9号患牙A泳道上同一位置出现，而在B、C、D泳道均消失或减弱。图3 编号7-9患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像Figure 3 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of subgingival plaque in abutments 7-9通过Quantity One 4.3.0图像处理软件分析显示，虽然变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化，见表1，但条带的强度和位置则出现了较明显变化。对变性梯度凝胶电泳各泳道图像的相似系数(Cs)进行比较分析结果显示，患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像在镍铬合金烤瓷修复体拆除后发生了明显变化，而且其变性梯度凝胶电泳图像在修复体拆除前与对侧同名牙的差异较大，随着拆除后时间的推移其变性梯度凝胶电泳图像则越来越接近于对侧同名牙，见表2。10 11 12A B C D A B C D A B C D注：A、B、C和D分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月和对侧同名天然牙。变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化，但条带的强度和位置则出现了较明显变化。图4 编号10-12患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像Figure 4 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of subgingival plaque in abutments 10-12表1 龈下菌斑变性梯度凝胶电泳图谱中各泳道的条带数Table 1 The number of bands in each lane in denaturing gradient gel electrophoresis E profiles of subgingival plaque 患牙编号修复体拆除前修复体拆除后1个月修复体拆除后3个月对侧同名天然牙 123252421 224242222 323262419 419232322 524222121 622212223 722212323 824212124 925252325102324232511212222261223222319s22.91.723.01.822.61.022.52.3注：变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化。2.3 变性梯度凝胶中特异性16S rDNA片段的基因序列分析 虽然各组患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像在拆除原镍铬合金烤瓷修复体后出现的变化也各不相同，但有一些变化则是在多组出现且变化较明显。实验选择了在2，3，4号患牙的A泳道上均在同一位置出现，而在B、C、D泳道消失或减弱的条带，以及在5，6，8、9号患牙A泳道上均在同一位置明显出现，而在B、C、D泳道消失或减弱的条带作分析，分别选择其中2号A泳道上的条带(见图1黑色箭头所示)和位于8号A泳道的强度较高的那条条带(见图3黑色箭头所示)作切胶、克隆、16S rDNA片段的基因序列分析。分析结果显示，2号A泳道上的条带的16S rDNA基因序列与啮蚀艾肯菌的基因序列相似度为98%，8号A泳道条带的基因序列与直形弯曲菌基因序列相似度为96%。此外，本实验还对1号患牙A泳道上出现的一条带(见图1黑色箭头所示)进行了切胶、基因序列分析，该条带在1号患牙B、C、D泳道上均明显减弱，而且在其它患牙的变性梯度凝胶电泳图像上也基本没有出现或较弱，分析结果显示，该条带的基因序列与隐藏优杆菌有98%的基因序列相似度。表2 变性梯度凝胶电泳图谱中患牙修复体拆除前、修复体拆除后1个月、修复体拆除后1个月及对侧同名天然牙之间的相似系数Table 2 Coefficient of similarity between lanes of A, B, C, D in denaturing gradient gel electrophoresis profiles of subgingival plaque (%) 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112A-B70.384.482.186.480.084.053.371.856.4A-C54.574.455.873.787.880.084.462.280.040.950.034.1A-D63.465.151.380.079.178.981.866.772.022.251.263.2B-C69.666.766.791.992.795.093.371.492.051.153.750.0B-D74.457.868.276.985.087.290.975.676.057.145.554.1C-D83.779.175.095.087.285.088.980.080.066.748.956.4s70.313.164.817.864.616.974.517.770.714.377.213.6注：A、B、C和D分别代表修复体拆除前、拆除后1个月、拆除后3个月和对侧同名天然牙。患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像在镍铬合金烤瓷修复体拆除后发生了明显变化，而且其变性梯度凝胶电泳图像在修复体拆除前与对侧同名牙的差异较大，随着拆除后时间的推移其变性梯度凝胶电泳图像则越来越接近于对侧同名牙。3 讨论 Discussion3.1 16S rRNA序列分析和变性梯度凝胶电泳技术 近些年来国内外学者分别采用不同的分子生物学方法对细菌的16S rRNA进行了大量研究，并得到了广泛的细菌16S rRNA基因序列库12-15。该方法可以检测常规方法不能分离培养或生长缓慢的细菌16-18。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，是高度保守基因，其内部结构由保守区及可变区两部分组成。保守片段反应了生物物种间的亲缘关系，而变异片段则表明了物种间的差异，这些保守的或变异的特征性核苷酸序列是不同物种生物鉴定的分子基础19-22。基于16S rRNA基因的以上特性，可针对细菌变异区设计特异性引物进行PCR扩增，从而将细菌鉴别开；也可设计细菌保守区通用引物，PCR扩增所有细菌，用来比较微生物群落的多样性和监测微生物群体的动态14,15, 22。总之，利用编码16S rRNA基因的PCR技术可快速、灵敏地检测样本中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，特别是无法人工培养的那些细菌，目前已逐渐成为细菌鉴别和分类的“金标准”。实验即以16S rRNA基因的PCR技术为基础，根据16S rRNA基因保守序列设计通用引物，扩增龈下菌斑中的全细菌，并结合变性梯度凝胶电泳技术来监测龈下菌群的变化。变性梯度凝胶电泳技术最初由Fischer和Lerman提出，是用来检测DNA片段中单个碱基改变的点突变的一种电泳技术23。目前，变性梯度凝胶电泳已被引入到分子微生物生态学领域，现已广泛应用于环境微生物生态、人类和动物肠道微生物生态等的分析研究中24-25。该技术是利用梯度变性胶来分离DNA片段，其基本原理是设计5端带有GC夹的通用引物，以提取的微生物样品的总DNA为模板，进行PCR扩增；DNA片段在变性梯度凝胶中泳动到一定浓度的变性剂时，双链DNA发生部分解链而呈分枝状，迁移速度逐渐减慢直至停止；由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，即使仅有一二个碱基不同，其解链过程也不相同，因此在凝胶上形成不同的DNA条带，每一个DNA条带即代表一类细菌。变性梯度凝胶电泳技术结合相关统计软件，可以用来观察和监测微生物群落或单个菌群的组成变化26。大量研究表明，变性梯度凝胶电泳检测效率高、快速易行，且无需放射标记，特别适用于描述复杂的生物群体，此外，通过选择性的切胶、测序，还可以监测环境标本中特异微生物的存在24-27。实验将变性梯度凝胶电泳技术引入到镍铬合金烤瓷修复体对龈下菌群影响的研究中，通过龈下全细菌DNA图谱分析，摆脱了细菌培养、鉴定工作的繁琐，同时又能够更全面、动态的观察龈下菌群的组成和变化情况。3.2 镍铬合金烤瓷修复体拆除前后龈下菌群变性梯度凝胶电泳图谱的变化 实验研究了9例患者共12颗患牙在镍铬合金烤瓷修复体拆除前后的龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图谱，通过变性梯度凝胶电泳图像分析表明，患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图谱在修复体拆除后1，3个月相比拆除前均发生了明显变化，而且拆除后3个月相比拆除后1个月也发生了较明显变化；此外，患牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像在拆除镍铬烤瓷冠前与对侧同名牙的差异较大，而随着拆除后时间的推移其变性梯度凝胶电泳图像越来越接近对侧同名牙。这些结果表明镍铬合金烤瓷冠确实导致了修复基牙龈下菌群组成的变化，而在拆除镍铬合金烤瓷冠更换成金合金烤瓷冠或全瓷冠后，其龈下菌群的组成随着时间推移也逐渐发生变化，而且这种变化趋向于越来越接近正常对侧同名牙的龈下菌群构成。这个研究结果从另一角度论证了其他学者关于镍铬合金烤瓷修复体对牙周影响的一些相关研究。许多研究表明，镍铬合金烤瓷修复体戴入口腔后会导致龈沟液成分的改变3, 28-33。赵彤等29发现患者戴入镍铬合金烤瓷冠后，龈沟液中白细胞介素1 及天门冬氨酸转氨酶 水平明显增加。Li等30对采用镍铬合金烤瓷冠修复的上颌切牙龈沟液中的C-反应蛋白和肿瘤坏死因子进行了检测，也发现修复后龈沟液内C-反应蛋白、肿瘤坏死因子明显增高。Barnes等32检测到镍铬合金烤瓷冠修复后龈沟液中的NO浓度也随之增加。江泳 等28研究发现镍铬合金烤瓷冠修复后患者龈沟液量明显增加，而且龈沟液内的肿瘤坏死因子和弹性蛋白酶的含量也明显升高。龈沟液是结缔组织内的液体不断通过龈沟内壁上皮和结合上皮进入龈沟内所形成的，Darany等33认为龈沟液量的增加是牙龈炎症早期变化的敏感指标，其内各种炎症递质、酶和蛋白等成分与牙周组织疾病的发生发展都有着非常密切的关系。因此，推测镍铬合金烤瓷修复体导致龈沟液成分的变化，造成了修复体局部牙周微生态环境的改变，进而可能导致了龈下菌群构成的改变。实验发现不同患者间的正常对照组龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像存在较大差异，而同一患者的两颗正常对照牙龈下菌斑的变性梯度凝胶电泳图像则相似系数极高。这个结果说明即使是健康天然牙的龈下菌群构成在不同人群中也是有差异的，因而龈下菌群在一定范围内的组成变化并不一定会导致牙周疾病的发生。此外实验还发现，虽然各泳道的变性梯度凝胶电泳图像存在较多差异，但这些泳道的变性梯度凝胶电泳图像中都存在着一些共同的处于相同位置和强度的条带，还存在许多处于相同位置但强度不同的条带，而且变性梯度凝胶电泳各泳道的条带总数无明显变化。这说明各样本的龈下菌群的种类变化不明显，只是部分菌种的构成比例发生了变化。实验选择了一些特异性的条带作切胶、克隆、16S rDNA片段的序列分析，结果显示，在镍铬合金烤瓷冠拆除前的龈下菌斑中经常出现而在拆除后消失或减弱的变性梯度凝胶电泳图像中的条带其基因序列分别与啮蚀艾肯菌、直形弯曲菌和隐藏优杆菌有着较高的序列相似度，而这3个菌种目前认为可能与牙周疾病有密切关系34-37，但同时在健康牙周的龈下菌斑中也有较高的检出率38-39，因而，牙周疾病的发生可能是多种因素综合作用的结果。综上，镍铬合金烤瓷修复体导致了修复基牙龈下菌群组成的变化，且导致了部分牙周可疑致病菌构成比增加，其原因可能与龈沟内镍、铬等金属离子的析出有 关40。但对于镍铬合金烤瓷修复体是否一定会造成牙周的损伤及其机制尚待进一步研究。作者贡献：设计、实施、分析评估主要为第一作者，通讯作者主要负责实验指导，其余作者主要作为第一作者的助手，负责收集病例、样本采集、数据统计等。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求：参与实验的患者个体均自愿参加。学术术语：烤瓷牙-是在治疗的基牙或种植体上用高强度合金做成金属帽，在其表面涂上一层与天然牙色泽一致的瓷粉，最后粘结在牙根或基牙上，其做工极其复杂，集高温，铸造，粘结等技术为一体的高科技产品。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。4 参考文献 References1 刘梦桃,贾安琦.镍铬合金烤瓷修复体对局部牙龋组织损伤的机制J.国外医学:口腔医学分册,2004,31(1): 44-45.2 张荣和,宋琦,张勇.镍铬合金烤瓷冠组织面离子析出的研究J.国际口腔医学杂志, 2008,35(6):611-614.3 Imirzalioglu P,Alaaddinoglu E,Yilmaz Z,et al.Influence of recasting different types of dental alloys on gingival fibroblast cytotoxicity. 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