限制性内切酶考点小结.doc

限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。1 限制性核酸内切酶的基本知识来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。切割方式：错位切-产生两个相同的黏性末端，平切-形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。2.2 质粒切割要点归纳质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。2.4 酶切割后的DNA片段的连接如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因目的基因；目的基因载体；载体载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因目的基因；目的基因载体；载体载体。这些连接物也可以环化.。3 试题解析说明：为了突出重点，高考试题中只是把与限制性内切酶有关的内容保留，其余内容都进行了省略。例1 (2008高考海南卷)图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。解析 由于目的基因和质粒用同一种限制性内切酶切割，故切割得到的粘性末端一样，得到的DNA片段有两种，两两连接有三种情况。EcoRI酶切割时会破坏四环素抗性基因，因此插入了目的基因的连接产物就不能抗四环素了。由于EcoRI、BamHI两者酶切割后的粘性末端不同，故目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端不会发生任意连接答案 （1）目的基因载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-载体连接物 目的基因-载体连接物、载体-载体连接物 （4）EcoRI和BamHI例2 (2008高考江苏卷第32题)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗,饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。限制酶Alu IEco R IPst ISma I切割位点AGCTTCGAGAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCCCCGGGGGGCCC请根据以上图表回答下列问题:(5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用EcoR I和Pst I酶切,得到 种DNA片断。采用EcoR I和Sma I酶切,得到 种DNA片断。解析 由于M和X都是EcoRI酶切割出来的，故两者的粘性末端一样，连接之后的序列还是可以被EcoRI酶识别并切割。PstI能在M和N之间专一切点处切开,因此DNA将被切割成两个片段。EcoRI仍能切开M与X处,而SmaI的识别序列是-CCCGGG-，因为 N和Y重新结合形成的连接处的序列已经不是SmaI的识别序列了，因此SmaI不能切割此处了,故只能得到1个DNA片段。答案 (5)2 1例3 (2009高考江苏卷第34题)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因),据图回答下列问题。(1)将图中的DNA用Hind、BamH完全酶切后,反应管中有 种DNA片段。(2)图中表示Hind与BamH酶切、DNA连接酶连接的过程,此过程可获得 种重组质粒;如果换用Bst与BamH酶切,目的基因与质粒连接后可获得 种重组质粒。解析 图中DNA上有Hind酶的一个识别序列、BamH酶的两个识别序列，完全酶切则分成四段，其中有两段的两端含相同的粘性末端。另外两段只有一边含粘性末端。Bst酶与BamH酶两种酶的识别序列相同，切出来的粘性末端也一样。Hind与BamH酶切质粒会把质粒上的一段DNA切除掉，留下两个不同的粘性末端缺口，换用Bst与BamH酶切质粒则只是把质粒切断，质粒不会丢失DNA片段，留下两个相同的粘性末端缺口。答案 (1)4 (2)2 1 例4 (2009高考福建理综卷第32题)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答: (1)构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶 ,对 进行切割。解析 (1)从图可看出,只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结构的完整性,所以构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶Pst、EcoR两种酶,对抗病基因的DNA和质粒进行切割。答案 (1)Pst、EcoR 含抗病基因的DNA、质粒 例5 (2009高考上海卷第37题)人体细胞内含有抑制癌症发生的p53基因,生物技术可对此类基因的变化进行检测。 (3)上图表示从正常人和患者体内获取的p53基因的部分区域。已知限制酶E的识别序列为-CCGG-,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的p53基因部分区域(见上图),那么正常人的会被切成 个片段;而患者的则被切割成长度为 对碱基和 对碱基的两种片段。(4)如果某人的p53基因部分区域经限制酶E完全切割后,共出现170、220、290和460对碱基的四种片段,那么该人的基因型是 (P+表示正常基因,P-表示异常基因)。解析 (3)据图分析可知限制酶E有两个切点,故正常人会被切成三个片段。(4)由正常人被限制酶E切出来的四种片段可知,该人的基因型是P+P-。答案 (3)3 460 220 (4)P+P-例6 （2010高考江苏卷第27题）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna 切割，原因是 。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。解析 质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个Sma的切点，因此被改酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。3 质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有Sma酶切位点，都可以被Sma破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA4 只使用EcoR I，则质粒和目的基因两端的粘性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH 和Hind 剪切时，质粒和目的基因两端的粘性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。答案 （1）0、2（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 （4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化例7 基因工程中,需使用的限制酶切割目的基因和质粒,便于