样本选择 引物.doc

用于分型的引物的设计与方法采用Okamoto法根据核心区设计共用引物和型特异性引物，RT-巢式PCR法进行基因分型，本方法第一次PCR扩增c区第139位一第410位核昔酸间的272bp片段。第二次PCR扩增的是该270bp中的一小段，共同引物均从第148位核昔酸开始，而型特异性引物的末端位置各不相同，因而各型扩增片段长度不同。本方法通过巢式两次PCR扩增可提高分型的精确性。第二次PCR扩增产物，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外下可见到被溴化乙啶染红的不同长度片段: ：1a型/I型(49bp)、lb型/II型(144bp)、2a型/III型(174bp)、2b型/IV型(123bp)、3a型/V型(88bp)，6a型(524bp)引物如下：P1：5ATGTACCCCATGAGGTCGGC 3P2：5CGCGCGACTAGGAAGACTTC3Nest P：5AGGAAGACTTCCGAGCGGTC3P HCV-1a：5TGCCTTGGGGATAGGCTGAC3P HCV-lb：5GAGCCATCCTGCCCACCCCA3P HCV-2a：5GCCCCATGAAGGGCGAGAAC3P HCV-2b：5ACCCTCGTTTCCGTACAGAG3P HCV-3b：5GCTGAGCCCAGGACCGGTCT3P HCV-6a：5TCGAGGACGGGATCAATTATG3P1、P2为扩增C区的引物，Nest P为分型时的共用引物，P-1a、P-1b、P-2a、P-2b、P-3b、P-6a为各型的型特异性引物，其中P2、Nest P为上游引物，其它为下游引物。具体分型方法：从患者血清内提纯HCVRNA，用逆转录的方法，逆转录出cDNA，再用巢式多聚酶链反应(nestedPCR)方法扩增HCV C区基因组序列，用第二轮PCR产物直接进行电泳分析.，步骤如下：一：RNA的提取二：RNA逆转录成cDNA 引物：下游引物P1三：巢式PCR(nested PCR)方法扩增C区基因3.1第一轮PCR:反应体系:共50ulcDNA 5ul10xBuffer 5ulMgC12 3uldNTP mixture 1ulTaq酶 0.5ulPrimer 1 1ulPrimer2 luldd H2O 33.5ul反应条件:反应体系放入94 3分钟后，置于94 30秒(变性)，5530秒(退火)，7245秒(扩增);共35个循环。然后再放入7210分钟(延伸)。3.2第二轮PCR:反应体系:共50ul第一轮产物 2.5ul10xBuffer 5ulMgC12 3uldNTPmixture 1ulNest P 1ulP1a lulP1b 1ulP2a 1ulP2b 1ulP3b lulP6a lulTaq酶 0.5ulddH2O 31ul反应条件:反应体系放入943分钟后，置于9430秒(变性)，6030秒(退火)，7245秒(扩增);共30个循环。然后放入72中10分钟(延伸)。2.4用聚丙稀酞氨凝胶电泳分析进行HCV分型。电泳在室温下，以5ul第二轮产物于10%的聚丙烯酞氨凝胶中进行。所得凝胶电泳图，经数码凝胶图像处理系统在紫外灯下核定。la型/I型(49bp)、lb型/11型(144bp)、2a型/111型(174bp)、2b型/IV型(123bp)、3a型/V型(88bp), 6a型(524bp)包膜区变异的样本选择流程图363全部随访对象442人分组为HCV、HIV+HCV？ Yes NO78分组为HCV分组为HCV+HIV140223本次有无抽血？全部入选2人随机抽取3人15159981211