细菌总DNA(total DNA, genomic DNA)提取和凝胶电泳检测.doc

细菌总DNA（total DNA, genomic DNA）提取和凝胶电泳检测总DNA（total DNA, genomic DNA）凝胶电泳1.学习细菌总DNA提取的原理和方法2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法关键词：电泳凝胶细菌细菌总DNAtotalDNAgenomic提取凝胶电泳基本概念：总DNA（total DNA, genomic DNA）凝胶电泳实验目的1.学习细菌总DNA提取的原理和方法2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法实验材料1.菌种自己分离纯化后的细菌菌株2.试剂TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L NaCl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇3. 仪器高速台式离心机、紫外检测仪4. 其他材料：离心管、无菌吸头、移液器等实验步骤和过程（一）细菌总DNAD 提取革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75l 溶菌酶（20mg/ml）溶液，40C保温30分钟3. 加50l, 10% SDS, 5l 蛋白酶K （20mg/ml）,混匀, 37保温30分钟4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管中。7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，离心沉淀DNA8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50l TE溶解DNA, -20保存革兰氏阴性菌总DNA提取方法方法一：1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8）.2. 37温浴2h，3. 加入1.5ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清4. 用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入40l的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20沉淀DNA1h，12000r/min 离心10min5. 收集DNA沉淀，用100l TE溶解方法二：1. 加入DNA提取液100 mmol/l，（Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/lNacl，1%pvp , 2%SDS，pH=8）旋涡混匀2. 在摇床上250 r/min振荡2h，4沉淀DNA 1 h，13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀3. 用100lTE溶解DNA方法三：1.加入DNA提取液（100 mmol/l，Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/l磷酸钠，1.5mol/l Nacl，1%CTAB，pH=8），20l蛋白酶K（20mg/ml）和500l溶菌酶（0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8），37温浴2h。2.加入1 ml 20%SDS，65水浴过夜3.加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡，12000 r/min 离心10min4.取上清，用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入等体积TE，再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h5.12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀，用200lTE溶解细菌DNA提取如果是革兰氏阴性菌可采用以下方法（热烈解法）：（1）细菌过夜振荡培养，（2）离心取菌体，（3）500L灭菌双蒸水洗一次，（4）离心取菌体，（5）用适量灭菌水（视菌体浓度，通常70200L）重悬，（6）100水浴10min，置于冰上5min，（7）1300rpm离心510min，（8）取上清，即为总DNA，4或-20保存。下面方法适用于革兰氏阳性和阴性菌(1)菌体培养，获得足够的菌体，(2)菌体收集，(3)辅助裂解：如果是G+菌，应先加溶菌酶100g/mL 50L。37处理1h。(4)裂解：向每管加入200L裂解缓冲液缓冲液含(终浓度)40mmoL/L Tris-HCl，pH8.0 20mmol/L乙酸钠，1mmol/L EDTA，1SDS，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞；(5)接着向每管加入66L 5mol/L NaCl，充分混匀后，12 000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积的用Tris饱和的苯酚，充分混匀后，12 000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质；(7)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12 000r/min离心3min,去除苯酚。小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15 000r/min 高速离心15min，离心弃上清液。(9)用400L 70的乙醇洗涤两次。(10)（真空）干燥后，用50LTE或超纯水溶解DNA，-20冰箱放置备用。还有方法适用于革兰氏阳性和阴性菌（饱和酚法）（1）收集细菌培养物，加入565L的TE缓冲液，轻轻吹打使重悬，（2）加30L的10% SDS和20mg/ml的蛋白酶K，混匀，37孵育3h以上或过夜，（3）将溶液冷却至室温，加入等体积的（600L）饱和酚，缓慢来回颠倒离心管10min，以小心混合，13000min离心5min以上，（4）取上清至另一管中，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），离心，（5）取上清至另一管，加入1/10体积的pH5.0 3M的NaAC和2倍体积的无水乙醇，混匀，-2015min以上，再离心12000rpm 15min，（6）纯点用75%乙醇洗一次，去上清，干燥，（7）加入50L的pH8.0的TE缓冲液，-20保存。细菌总DNA的提取和鉴定点击次数：130 发表于：2008-07-08 17:32转载请注明来自*来源：互联网【目的和要求】1.学会CTAB法提取细菌总DNA。2.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。【实验原理】DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。【实验试剂和器材】（一）试剂：菌株（E.coli ）；蛋白酶K（20mg/ml）；琼脂糖；标准DNA水解液1.10%SDS2酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）3.异丙醇；70%乙醇4LB培养基：蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。5TE缓冲液：10mM Tris HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。6 CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65使之溶解，然后室温保存。7TAE缓冲液（50）(pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。电泳时稀释成1 浓度使用。8溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成90.5g/ml 溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5g/ml。（二）器材：锥形瓶（250ml），1.5ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪【实验方法】（一）细菌总DNA的提取1.将菌株接种于液体LB培养基，37震荡培养过夜。2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。3.沉淀物加入567l的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30l 10%SDS和15l的蛋白酶K，混匀，于37温育1h.4.加入100l 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80l CTAB/NaCl溶液，混匀后再65温育10min。5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20l TE缓冲液(含RNaseA-25ng/ml)中，准备电泳检测。（二）琼脂糖凝胶电泳1.制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。2.加样：取0.5-1g 左右的样品，体积为10-20l，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。3.电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。4.染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。染液可反复多次使用。5.观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。【注意事项】1.溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。2.倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。谢谢各位战友了！您好，请问灭菌水的是什么啊？去离子水或者蒸馏水121度灭菌 细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。 一、水煮模板法主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养1824小时。2、刮取12接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，20摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20保存备用。5、取3.5ml菌悬液,加入184l10%SDS,混匀,加入37l10mg/ml蛋白酶K,混匀,37温育1小时6、加入740l5mol/LNaCl,再加入512lCTAB/NaCl,混匀,65温育10分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。8、上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20g/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot。编者建议：长时间保存DNA可放于-20，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、400ul 70%冷