肽与蛋白质HPLC分析和纯化手册.doc

第一章 简介：肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化30反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离，如图1所示的胰岛素变异物的分离。胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！RP-HPLC对相近胰岛素变异物的分离图1.RP-HPLC分离含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。色谱柱：VYDAC 214TP54 洗脱液：27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。科学文献中已有很多用RP-HPLC分离相似多肽的例子。含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样生长因子与其未氧化态类似物已得到分离，白细胞介素-2突变蛋白也已经得到分离。在最近的论文中，Kunitani及其同事提出，RP-HPLC的保留时间能提供保留在反相表面的蛋白质的结构信息。他们研究了30种白细胞介素-2 突变蛋白，并分离了几乎相同的突变蛋白。含氧化蛋氨酸的白介素与其自然状态得到分离，另外，单个氨基酸取代基也被与其自然状态分离。他们得出结论：蛋白质的结构在反相分离中非常重要，同时，RP-HPLC也能用来研究蛋白质的结构。在该过程中，他们展示了RP-HPLC技术对相似多肽的分离能力。RP-HPLC用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。制备RP-HPLC常常用于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚基和细胞功能。RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。反相HPLC广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解（脱酰氨和氧化）产物。用RP-HPLC分析完整蛋白质，能验证蛋白质的结构并测定降解产物。随着生物技术革命的扩展，该色谱技术的应用也随之扩大。在过去的几年中，仅涉及VYDAC反相色谱柱方面的专利数目就已呈现指数级的增长，如图2（又见参考资料74）。 用Grace Vydac反相HPLC色谱柱发表的专利数图2。美国专利局公布的1984-2000年间在专利中使用VYDAC反相HPLC色谱柱的专利数。第二章 多肽与RP-HPLC色谱柱的作用机制了解多肽与反相表面的作用机制对于理解RP-HPLC的多肽分离很重要。小分子的分离与分子在流动相和疏水性的固定相之间的连续分配有关。但是多肽分子很大，很难分配到疏水相之中；它们进入色谱柱后就吸附到疏水相的表面，直到有机调节剂的浓度达到临界浓度时才会脱附（图3）。脱附后，多肽分子顺着柱子洗脱下来，它们与固定相表面就只有轻微的作用了。 多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型图3.流动相中的多肽进入色谱柱。多肽的“疏水脚”吸附到疏水性的反相材料表面，当有机调节剂浓度升到临界浓度时，多肽就脱附下来了。可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大部分都暴露在流动相中，只有一部分“疏水脚”与反相表面接触。RP-HPLC是基于多肽之间“疏水脚”的微小差别来分离多肽的。“疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与结构的不同。多肽与疏水相之间吸附/脱附机制的关键由于脱附多肽所需的有机调节剂分子的数目（Geng和Regnier称之为“Z”值）非常精确，所以脱附只在很狭窄的有机调节剂浓度范围内发生。这使得多肽只有在有机调节剂达到临界浓度时才发生突然脱附，否则它们将全部被保留在色谱柱中（图4）。多肽脱附对精确浓度的敏感性，是分离多肽时RP-HPLC具有选择性的原因。当到达临界浓度时，多肽突然脱附并产生尖峰。“Z”值对蛋白质结构的敏感性和在调节剂临界浓度时的突然脱附，使得RP-HPLC能分离非常相似的多肽（见第2页）。分子保留时间与有机调节剂浓度图4. A：由于是通过分配而保留，联苯等小分子的保留时间随着有机调节剂浓度的增加而逐渐减少。 B：当有机调节剂浓度达到能脱附多肽的临界浓度时，溶解酵素等多肽的保留时间发生突然而剧烈的变化，证明了多肽反相表面之间相互作用的吸附/脱附模型。使多肽能够得以分离的“疏水脚”对分子结构非常敏感。RP-HPLC对蛋白质结构的敏感性，使其不仅能分离疏水脚不同的多肽，还能分离分子中其它地方存在差别的多肽。Kunitani和Johnson发现，由于结构的差异，非常相似的白细胞介素-2突变蛋白也能得到分离，包括存在一个氧化蛋氨酸的差别或单个氨基酸取代基的不同。Geng和Regnier发现，虽然“Z”值与变性蛋白的分子量有关，但是，具有完整三级结构的蛋白质比预想的要早洗脱出来，因为在蛋白质与固定相的相互作用中只涉及到“疏水脚”，蛋白质的其它部分是与流动相接触的。多肽在色谱柱中的吸附/脱附只发生一次。脱附后，多肽和反相柱子表面就没有什么相互作用了，随后的相互作用也不会对分离产生多少影响。这种相互作用的机制的实际结果是：多肽对有机调节剂的浓度非常敏感。多肽洗脱对有机调节剂浓度的敏感性如图5所示。溶菌酶的保留时间发生了很大变化，而乙腈的浓度相对地只有微小变化。多肽的保留时间对调节剂浓度微小变化的敏感性使得等度洗脱比较困难，因为有机调节剂地浓度必须维持在非常精确的范围内。多肽RP-HPLC分离通常采用梯度洗脱，即使梯度很小（即单位时间内有机调节剂浓度变化很小）。乙腈浓度对洗脱的影响图5.ACN浓度为39%时，溶解酵素的保留时间约为18分钟。ACN的浓度增加到40%时，保留时间减少一半还多，只有7.6分钟。ACN浓度增加到42%时，溶解酵素的保留时间又减少一半，只有3.1分钟。 色谱柱：VYDAC 214TP54 洗脱液：39%、40%、42%ACN+0.1%TFA。当等度分离不适用时，可以采用小梯度有效地分离相似的多肽。小肽进行色谱分离时分配和吸附同时发生。当有机调节剂浓度变化时，它们脱附的速度比发生分配的小分子要快，但与蛋白质相比，它们是逐渐脱附的（图6），说明其分离机制是混合的。把肽保留时间和侧链疏水性联系起来的努力部分是成功的，但是由于许多肽的三级结构的限制，这种相互作用只发生在分子中的部分位置上，造成了大部分模型预测的差异。由此可见，螺旋状肽上疏水残基的精确位置，在预测肽的保留值时很重要。由于大的多肽扩散缓慢，所以其RP-HPLC的峰比小分子的要宽。等度洗脱的多肽的峰宽是分子量的函数，肌球素等大分子肽的柱效只有联苯等小分子柱效的5-10。多肽通常采用梯度洗脱，即使梯度很小，因为与用等度洗脱相比这样能得到尖峰。多肽分离很少采用等度洗脱。肽的保留时间图6.很多肽在RP-HPLC色谱柱上的保留时间位于蛋白质和小分子之间。小肽Pentaphenylanine比小分子的联苯脱附得快，但比溶菌酶慢。小肽的色谱机理似乎是混合的。第三章 多肽反相HPLC分离中色谱柱的作用HPLC色谱柱为多肽吸附提供疏水性的表面。色谱柱由不锈钢管构成,内部填充微径、球形的吸附微粒，微粒通常采用硅胶，硅胶微粒的表面已经用硅烷试剂反应过以使其疏水。合成聚合物（比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯）也可以用作多肽的HPLC吸附剂。吸附剂的孔径HPLC吸附剂是多孔微粒，用于反应的表面大部分位于小孔中。因此，多肽分子必须进入孔中才能被吸附和分离。HPLC曾多年使用孔径约100的微粒。这种多肽色谱法很差，部分是因为许多多肽分子太大而无法进入这种直径的孔中。Grace Vydac为HPLC改进的大孔径(300 )球形硅胶微粒宣告了用RP-HPLC有效分离多肽的开始。今天，虽然有些肽(2000 MW)也能用100 孔径的微粒分离，但大多数多肽都是用孔径约300 的微粒填充色谱柱来完成分离的。吸附剂粒度色谱柱中吸附剂的粒度影响洗脱峰宽，小直径的微粒通常产生更尖的峰和更高的分离度。毛细分析和少量制备分离推荐使用5微米材料（色谱柱内径10mm)。直径大一点的实验室色谱柱通常装填10m的材料。内径大于22mm的过程色谱柱通常装填15 m或更大的微粒，其粒度分配也比用于分析型色谱柱的宽（见40-42页）。色谱柱的选择与样品分子的特性图7. 不同分子量和疏水性所推荐的粒度和结合力吸附相种类通过氯硅烷把疏水相键合到硅胶基质上就形成了反相HPLC吸附剂，这些硅胶基质分子上有一个能附着疏水基团的活性氯基。形成疏水相的烃基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的线性脂肪族烃。烃链的长度在蛋白质分离效果上一般没有什么不同。分离给定大小和疏水性的多肽时哪种固定相可能最有效有规可循，参见图7中的总结。对于肽和少于5000道尔顿的小分子蛋白质最好选用C18色谱柱。最小的分子和最亲水的肽通常在小孔的C18柱子上分离得最好。大于5000道尔顿的蛋白质或小分子多肽非常疏水，最好选用C4色谱柱。C8柱与C18色谱柱的应用差不多，但分离个别肽时有时表现出不同的选择性和分离能力。苯基柱没有C4柱子那么疏水，所以对有些多肽表现出独特的选择性。反相表面的细微差别有时会造成RP-HPLC对多肽选择性的不同，可以利用这一点来优化特定肽的分离。如图8所示，肽分离的选择性可能受疏水表面性质的影响。图中所示的五种肽的选择性在C18和C4色谱柱上几乎一样，虽然在C4柱子中的保留时间短。苯基柱与C18柱相比，保留时间短，选择性也不同。缓激肽含有两个苯丙氨酸，与其它肽相比，其在苯基柱上的保留时间比在C18柱上稍长。不同反相色谱柱上的肽分离图8. 肽在不同反相色谱柱上的分离。 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18); 214TP54 (C4); 219TP54（苯基） 洗脱液：15-30%ACN+0.1%TFA，1.0mL/min，30min 样品：1.催产素， 2.缓激肽， 3.血管紧张素II， 4.神经紧张素， 5. 血管紧张素I血管紧张素I含有一个组胺酸，血管紧张素II含有两个组胺酸。在苯基柱子上，这两者都比其它肽洗脱得早。分离肽时（比如蛋白质消化物中的肽），最好试用不同的疏水相，以选出针对特定肽混合物具有最佳选择性的相来。肽的RP-HPLC分离基于肽和反相表面之间的微妙作用。 反相表面的微小变化能影响肽的分离，虽然小但很重要。有些肽的分离对键合在硅胶基质上的疏水相的密度和均匀度非常敏感（图9）。低碳装填色谱柱分离度的提高图9.低碳装填C18RP-HPLC色谱柱（B）分离在标准碳装填色谱柱（A）上只有部分分离的两种肽。色谱柱：A. VYDAC 218TP52-标准C18,5m,2.1x250mm B. VYDAC 218LTP52低碳负载C18，5m,2.1x250mm 洗脱液：6 mM TFA/4mM HFBA，11-95%ACN,0.25mL/min,75min 样品：Asp-N蛋白质消解物。不同的反相吸附剂在分离蛋白质酶消化物中的肽碎片时可能表现出不同的选择性。用两种RP-HPLC色谱柱分离-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，结果表明：不同的相有时对肽的反相分离具有微小的影响（图10）。与通常使用的C18色谱柱相比，C4柱的保留时间稍短，肽碎片洗脱图形也有某些程度上的不同。测试不同的色谱柱是确定哪个柱子分离度最好的唯一实用的方法。有些实验室利用反相色谱柱的选择性差异来进行肽的二维分离。不同反相色谱柱对胰蛋白酶消化液的分离图10. 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18)；214TP54 (C4)；洗脱液：0-30%ACN+0.1%TFA水溶液，1.0 mL/min，60min。 样品：-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化液。什么是聚合物键合？它又是怎样影响肽的选择性的？反相HPLC吸附剂一般通过把含有一个活性氯的氯硅烷烃键合到硅胶基质上制成。这些就形成了所谓的单体键合相，它在硅胶基质上有一个附着点。也可以用具有多个活性氯的氯硅烷烃，这就是所谓的聚合物键合相，单个氯硅烷烃在相中交联并在硅胶基质上面形成硅氧烷聚合物，同时附着多个疏水链。虽然单体键合相与聚合物键合相的疏水性和分离特性相似，但在分离肽时，尤其是蛋白质的酶消化物中的肽时，它们会具有不同的选择性。这种不同的选择性为色谱工作人员优化蛋白质消化物和其它肽的选择性和分离度提供了更多的选择空间。图11给出了用单体键合吸附剂和聚合物键合吸附剂分离一系列合成多肽的例子。这些肽分离选择性的明显差异已经标出，但同时也提供了进行肽分离时对色谱柱的另一种选择。单体键合与聚合物键合C18反相色谱柱对合成肽的分离图11.色谱柱：聚合物键合色谱柱VYDAC 218TP54与238TP54单体键合色谱柱(C18,5m,4.6x250mm) 洗脱液：10-40%ACN+0.1%TFA，30min。 流速：1.0 mL/min。合成聚合物吸附剂的作用虽然硅胶HPLC色谱柱在酸性pH和周围温度的温和条件下表现良好，但在极端条件（高pH、高温）下，硅胶色谱柱的效果就会降低。合成聚合物（比如比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯）能为多肽分离提供机械强度高的基质。硅胶色谱柱在中度pH与温度的操作环境下表现良好，但有时也会需要在比常规pH、温度高或在高浓度的离液剂（比如盐酸胍）中操作的需要。聚苯乙烯- 二乙烯基苯等机械强度高的合成聚合基质在苛刻的条件下比较稳定，可以作为实用的硅胶替代品。图12表示的是用合成聚苯乙烯- 二乙烯基苯色谱柱对几种多肽的分离。其性能和硅胶色谱柱相似，这样就使在相对苛刻的条件下用合成聚合基质进行多肽分离成为可能。PS-DV3色谱柱对几种肽的分离图12.合成聚合物色谱柱（聚苯乙烯-二乙烯基苯）对肽的分离。 色谱柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5m,4.6x150mm) 洗脱液：1530% ACN+0.1% TFA，15min。 流速：1.0mL/min 肽：1.催产素 2.缓激肽 3.神经紧张素 4. 神经紧张素18 5.血管紧张素III 6. val-4血管紧张素III用合成聚合物制成的分离材料的一个优点是，它们在pH极值时不分解。这样，在色谱后能使用强酸或强碱溶液作为清洗剂把蛋白质或其它物质从色谱柱上洗下来，见图13，在这个例子中，基于聚苯乙烯- 二乙烯基苯的色谱柱可以用强碱（1N氢氧化钠）和强酸（1N硫酸）进行清洗。清洗前、用强酸清洗后和用强碱清洗后肽的色谱分析都产生相似的峰形、保留时间和分离度，这证明用强试剂清洗柱子并不会对色谱柱的性能产生负面影响。色谱柱用极值pH清洗前后对肽的分离情况 图13.用强试剂清洗前（A）、用1N NaOH清洗后（B）、用1N硫酸清洗后（C），合成聚合物（聚苯乙烯-二乙烯基苯）色谱柱对肽的分离情况。 色谱柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5m,4.6x150mm) 洗脱液：1530%ACN+ 0.1%TFA，15min 流速：1.0 mL/min 肽：1.催产素 2.缓激肽 3. 血管紧张素III 4. 章鱼素 5.神经紧张素色谱柱尺寸：柱长影响蛋白质分离的吸附/脱附几乎全部发生在色谱柱的顶端。因此，柱长并不显著影响蛋白质的分离和分离度。于是，常用5-15cm的短柱分离蛋白质。蛋白酶消化物中的小分子肽用长柱子分离较好，15-25cm长的色谱柱常用于合成肽、天然肽与酶消化标记物的分离。例如，Stone和Williams发现：与用150mm柱（80个峰）和50mm柱（65个峰）相比，用250mm柱子（104个峰）能 从羧甲基转铁蛋白的胰蛋白酶消化物中分离出更多的肽碎片。柱长对分离的其他方面也有影响。样品容量样品容量是色谱柱体积的函数。对等直径的柱子而言，柱子越长样品容量越大。柱压柱压与柱长成正比。当用异丙醇等粘性更大的溶剂时，较短的柱子会产生较低的柱压。柱子尺寸：直径柱子直径不影响峰分离，但影响进样、溶剂使用和检测灵敏度。随着HPLC柱子直径的减小，流速相应降低，由此，溶剂的使用量减少，检测灵敏度提高。液质(LC/MS)联用时，直径非常小的HPLC柱子尤其有用。分析1-200微克多肽样品的分析柱标准直径是4.6mm。较大直径的色谱柱用于大量多肽的纯化（见40-48页制备分离）。近年来，小直径柱子（0.075mm到2.1mm）的使用有所增加，因为小直径柱子有以下优点：减少溶剂用量用于毛细色谱柱和小孔色谱柱的流速为每分钟几微升（见50页附录A）。低流速能显著减少多肽分离所需的溶剂量。增加检测灵敏度低流速的小孔色谱柱洗脱多肽所需的溶剂体积较少。检测器反应随着流速的降低而增强。流速200mL/min的窄径柱的灵敏度是流速1.0mL/min分析型色谱柱的六倍。能处理小量样品检测灵敏度增加意味着能检测小量样品。用窄径RP-HPLC柱能分离和收集5纳摩尔的胰蛋白酶消化产物。与质谱接口小孔色谱柱可以直接将HPLC洗脱液转移到质谱接口中，用精密的MS仪器可对阿摩尔(10-18)级的单个样品进行常规检测。（见28-31页LC/MS）。小直径色谱柱的当今趋势窄径柱内径2.1mm的微孔柱流速为100-300mL/min。对于大多数想减少溶剂用量、提高检测灵敏度的实验室来说，微孔柱是一个实用的措施。大部分标准HPLC系统都能在这些低流速下运行，而很少需要或不需要修改。200mL/min左右的微孔柱与空气辅助质谱有很好的接口。微孔柱和毛细柱虽然使用直径1.0mm或更小的色谱柱，溶剂用量明显减少、检测灵敏度也有所提高，但是，它们的HPLC系统需要修改，或用于该目的的特制仪器。进行数据流分割后，毛细色谱柱能与电喷雾甚至纳升电喷雾质谱仪接口。 Davis和Lee的在一篇论文中提供了用微孔柱和毛细管柱取得最佳性能的有价值的信息，值得使用小孔色谱柱的人阅读。很多期刊都有关于质谱与毛细管柱联用的详细论文（见26-29页）。例子微孔柱。图14表示的是用微孔柱（内径1.0mm）对血红素的胰蛋白酶消化物的分离。用微孔柱（1.0mm）对血红素的胰蛋白酶消化物的分离图14. 用微孔RP-HPLC色谱柱对血红素的胰蛋白酶消化物的分离（参考文献26）。 色谱柱：C18, 1.0x250mm(VYDAC 218TP51)。 流速：50 L/min 洗脱液：0-40%梯度的B，50min，溶剂A为0.1% TFA水溶液，溶剂B为0.1% TFA乙腈溶液。 毛细管柱。图15所示的是用内径75m的毛细管柱对肌球素的胰蛋白酶消化物分离的例子。毛细管柱（75m）对肌球素的胰蛋白酶消化物的分离图15. 毛细RP-HPLC色谱柱对肌球素的胰蛋白酶消化物的分离。 色谱柱：C18 (VYDAC 218MS), 内径75m，毛细管柱 流速：0.5 L/min 洗脱液：水/TFA/乙腈的梯度洗脱。毛细管柱进样量。图16表示的是用内径300m的毛细管柱对3皮摩尔BSA的胰蛋白酶消化物的分离，采用质谱检测。 毛细管RP-HPLC色谱柱对BSA胰蛋白酶消化物的分离图16.用内径300m的毛细RP-HPLC色谱柱对BSA的胰蛋白酶消化物的分离。 样品：3皮摩尔 色谱柱：VYDAC 218MS5.305 5m, 300 A, 聚合物-C18反相柱(300m 内径x 50mm柱长). 流速：5 L/min. 流动相: A = 0.1%甲酸，98%水,2% CAN；B = 0.1% 甲酸, 98% ACN, 2%水。 梯度：3%B保持0-5分钟，然后从3%B渐变到65min时的50%B，最终70min时渐变到75%B。 检测器：质谱（MS）。 （a）总离子数。(b)基峰强度。 基峰是指色谱图中每次振幅最大时的单个质谱峰。基峰的色谱图强调了含有单个主要分子的峰，消除了异常峰和噪声。第四章 分析条件：反相HPLC多肽分离中流动相和温度的作用把多肽从RP-HPLC柱子上脱附和洗脱下来用的是含有机调节剂和离子对溶剂或缓冲液的水溶剂。有机调节剂把多肽从疏水性表面溶解并脱附下来，同时离子对试剂或缓冲液调节洗脱pH值，并与多肽相互作用以加强分离。洗脱采用的是逐渐提高色谱时有机溶剂浓度（溶剂梯度）的方法。当溶剂达到能引起脱附的浓度时，多肽就从色谱柱子上脱附并洗脱下来。有机调节剂有机试剂的作用是把多肽分子从疏水性的吸附表层脱附下来，慢慢升高有机溶剂的浓度（梯度），直到多肽脱附并洗脱下来。乙腈（ACN）乙腈（ACN）是最常用的有机调节剂，这是因为它： 易挥发，容易从收集的组分中除去； 粘度低，柱压小； 短波几乎无紫外（UV）吸收； 经长期使用证明，其在RP-HPLC多肽分离中可靠。异丙醇 异丙醇常用于大分子蛋白质或非常疏水的蛋白质。异丙醇的主要缺点是粘度大。为了降低异丙醇的粘度而保持其疏水性，我们建议使用乙腈：异丙醇为50:50的混合液。在有些情况下，在乙腈中加1-3%的异丙醇能增加蛋白质的回收率。乙醇乙醇常用于过程规模纯化。乙醇是一种优良的RP-HPLC的溶剂，它价格低，与FDA等管理机构所熟悉。乙醇已用于洗脱疏水性的跨膜蛋白质，也用于纯化处理。甲醇或其它溶剂甲醇或其它溶剂与常用的溶剂相比没有什么优点，而且不用与多肽分离。洗脱梯度洗脱多肽几乎总使用梯度溶剂。慢慢增加有机溶剂的浓度，能得到最尖锐的峰和最好的分离度。多肽分离通常首选梯度洗脱。等度洗脱往往产生宽峰，所以等度洗脱时最好选用非常小的梯度。典型的溶剂梯度是每分钟有机调节剂浓度增加的斜率为0.5-1%。像每分钟0.0 5-0.1%这样极低的梯度能获得最大的分离度。图1（见第2页）中胰岛素变异物的分离所用的梯度斜率每分钟只有0.25%。图17表明，对蛋白质来说，减少梯度的斜率通常能提高分离度。采用低梯度时酶亚基分离度提高图17.色谱柱：C18 (VYDAC 218TP104) 流速：1 mL/min 洗脱液：如图所示梯度，梯度从25%到50%ACN的TFA水溶液。 样品：细胞色素C氧化酶亚基。 数据来自参考文献21。为了达到最佳重现性和平衡，要避免使用极限浓度的有机调节剂。我们建议，有机调节剂的起始浓度不要低于3-5%。起始浓度低的有机调节剂梯度会因为柱子表面很难“润湿”，而引起色谱柱平衡时间过长或没有重现性。我们建议有机调节剂的结束梯度不要超过95%。有机浓度过高会洗去全部有机相上的水，也会使柱平衡更加困难。梯度斜率对肽选择性的影响由于有些肽和反相柱子表面发生作用的方式有微小的差异，所以溶剂梯度的斜率可能会影响肽的选择性，由此影响肽之间的分离度。通过在不同的梯度时间，用不同的梯度斜率分离人生长激素的胰蛋白酶消化物，可以很好阐明这种影响。图18中是在三种不同的梯度斜率（时间），对人生长激素的胰蛋白酶消化物一些碎片的分离。随着斜率的降低，碎片9和10的表现和预期的一样，即分离度随着梯度斜率的降低（梯度时间增加）而提高。但是，碎片11和12表现不同。分离度随着梯度斜率的降低而减小，这表明改变梯度斜率时选择性发生了变化。如果要改进方法并考查该方法对每一肽对的影响，当温和地改变梯度斜率时，要对这种影响进行监控。不同梯度时间肽的分离图18.梯度时间（坡度）对肽分离选择性的影响。 色谱柱：C18,150x4.6mm 流速：1 mL/min 洗脱液：A.45min B.115min C.180min时梯度变化从060% ACN+0.1% TFA水溶液 样品：人生长激素的胰蛋白酶消化物。消化物碎片9、10、11、12、13。数据来自参考文献38。离子对试剂和缓冲液离子对试剂或缓冲液调节洗脱pH值，并与多肽作用，从而加强分离。三氟乙酸应用最广的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），其应用广泛的原因是： 易挥发，易于从收集组分中分离； 短波段几乎无紫外（UV）吸收； 经长期使用证明，其在RP-HPLC多肽分离中可靠。TFA通常使用的浓度为0.1%（w/v）左右。0.5%的TFA浓度用来溶解更大分子的或更疏水的蛋白质；低浓度的TFA则偶尔用于胰蛋白酶消化物的分离。虽然新发展的色谱柱允许使用更低浓度的TFA，但当TFA浓度低于0.1%时，蛋白质的色谱图峰形会退化（见28页）。若用TFA浓度不变的洗脱梯度，当在210-220nm检测时，有时会出现基线漂移。水溶剂到非水溶剂的介电常数的变化会影响电子相互作用，反过来影响190-250nm范围的吸收光谱，导致在很多反相分离中出现基线漂移。为了减少或消除由TFA光谱吸收造成的基线漂移，尽可能把波长调整到215nm，并在B液中比A液少加15%的TFA以补偿基线漂移。比如，A液中用0.1%的TFA，B液中用0.085%的TFA。使用质量好的和小量的TFA很重要。劣质的或过期的TFA可能会含有杂质，这些杂质在色谱图中会出现假峰（见附录B）。TFA浓度对选择性的影响三氟乙酸的浓度会影响特定肽对的选择性或分离度。虽然流动相中TFA的浓度通常在0.05-0.1%之间，但改变TFA的浓度也会对肽的选择性产生微小的影响，见图19。这就意味着，要得到好的重现性，在肽分离方法中，谨慎控制TFA的浓度很重要。这也提供了优化肽分离度的另一种方法。选择了色谱柱和梯度条件后，通过轻微改变TFA的浓度，能进一步优化肽对之间的分离度。TFA浓度对肽选择性的影响图19.TFA浓度不同造成肽分离模式产生明显的差异。 色谱柱：C18 (VYDAC 218TP54) 流速：1 mL/min 洗脱液：TFA水溶液中梯度变化0-50% CAN，浓度如图所示。 样品：脱铁转铁蛋白的胰蛋白酶消化物。 注：图中显示的是色谱图的一部分。虽然TFA广泛用于离子对试剂，但使用其它试剂也能得到比TFA更高的分离度。在对五种小肽的分离中（图20），有些肽用磷酸盐得到了比用TFA更尖的峰，使催产素与缓激肽的洗脱顺序颠倒了过来。最后三个峰用磷酸盐比用TFA要更尖，这是因为磷酸盐与碱性侧链发生了反应，增加了肽的硬度。缓激肽在用磷酸盐时比用TFA洗脱得早，因为TFA与缓激肽中的两个精氨酸发生配对，导致保留时间相对延长。另外，在TFA分离时隐藏着的两个小杂质，在用磷酸盐分离时显现出来了（图20B）。盐酸也颠倒了催产素与缓激肽的洗脱顺序，并分离出用TFA时看不见的杂质（图20C）。肽分离时TFA及替代性离子配对试剂/缓冲液的比较图20.使用TFA（A）、磷酸盐（B）、HCl（C）作为缓冲液/离子配对试剂洗脱五种肽。 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18,5m, 4.6x250mm). 洗脱液：15-30% CAN，1.0 mL/min，30 min加 A. 0.1%TFA B.20mM磷酸盐,pH2.0 C.5mM HCl,pH 2.0 肽：1.催产素 2.缓激肽 3.血管紧张素II 4.神经紧张素 5. 血管紧张素I。七氟丁酸（HFBA）能有效地分离碱性蛋白质，三乙胺磷酸盐（TEAP）已用于制备分离。有研究表明，用TEAP比用TFA的样品容量大。10-60浓度的甲酸已用于非常疏水性多肽的色谱分析。甲酸也用于肽的LC/MS分离，因为TFA降低了电喷雾接口的离子信号；挥发酸、甲酸已被证明在肽的LC/MS中很有效（见26-29页关于LC/MS的详细讨论）。Guo及其同事比较了TFA,HFBA和磷酸在肽洗脱中的使用，发现它们都有不同程度的选择性。pH对肽分离的影响由于酸性或碱性侧链的质子化或去质子化作用，肽分离对洗脱pH通常比较敏感，如图21所示。pH4.4时（图21B）五种肽都比在pH2.0时（图21A）洗脱得早，肽的保留时间也相对发生变化。这是肽中酸性基团的电离造成的。缓激肽和催产素在pH2.0时分离得很好，但在pH4.4时同时洗脱。pH6.5时（图21C）肽的保留时间比在pH4.4时要长，但洗脱顺序有很大不同，血管紧张素II,在pH2.0-4.4时第三洗脱，现在第一洗脱出来了。神经紧张素比催产素早洗脱，缓激肽与神经紧张素同时洗脱。这说明，pH对肽选择性产生很大影响，能作为优化肽分离的工具。 合成聚合物反相材料将实际pH的范围扩大到将近pH14（见13页的图13）。如图22所示，肽在高pH值时与低pH值时的洗脱有很大不同。在pH值从2变到9时，样品中肽的洗脱顺序发生了明显的改变。pH对肽分离的影响图21.用磷酸盐作缓冲液，pH在2.0、4.4、6.5时五种肽的洗脱。 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18,5m,4.6x250mm). 洗脱液：1530% CAN，1.0mL/min，30min；加A. 20 mM磷酸盐,pH 2.0 B.20mM磷酸盐，pH 4.4 C.20mM磷酸盐,pH 6.5 肽：1. 缓激肽 2.催产素 3. 血管紧张素II 4.神经紧张素 5.血管紧张素I.用HPLC从蛋白质消化物中分离肽碎片的操作条件 虽然大部分酶标记操作使用0.1%TEA作为李子配对试剂，但用别的离子配对试剂或高pH有时能得到更好的分离度。TFA广泛用作离子配对试剂，也是肽分离的最好起始点。但是也要考虑使用磷酸盐或盐酸等缓冲液，或研究pH的影响，以优化肽的分离。为了测试pH的影响，配制100mM磷酸盐溶液（pH约4.4）。取三分之一用磷酸调整到pH2.0，三分之一用NaOH调整到pH6.5。然后稀释每份溶液至10-20mM用作洗脱缓冲液。用TFA测肽的分离度，这三份磷酸盐缓冲液（pH2.0，pH4.4，pH6.5）和盐酸都是为了实现良好的肽分离而寻找最优试剂和pH条件的很好的方法。合成聚合物（聚苯乙烯-二乙烯苯基）色谱柱在低和高pH时对肽的分离图22.色谱柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB,5m,4.6x150mm) 洗脱液：1530% CAN，15 min，加A.0.1% TFA pH 2. B. 15 mM NaOH, pH 9. 流速：1.0 mL/min 肽：1.催产素 2.缓激肽 3.神经紧张素 4.神经紧张素1-8 5.血管紧张素III. 6. val-4 血管紧张素III流动相流速流速对多肽分离没有什么影响。流速不影响多肽从反相表面脱附和之后的保留时间。 只有有机调节剂浓度达到一定浓度时，多肽才发生脱附。所以蛋白质的分离，相对地不受流动相流速的影响。 洗脱流速会影响小肽的分离度，这是因为小肽在RP-HPLC色谱柱上的行为介于蛋白质和小分子之间（见第4页）。Stone和Williams发现，从羧甲基转铁蛋白的胰蛋白酶消化物中分离出的肽碎片的数量取决于洗脱流速。在分析型HPLC色谱柱上，流速0.2mL/min时，只分离出不到80个肽碎片，而流速为0.8 mL/min时能分离出116个肽碎片。流速在0.5-1.0mL/min之间，分离出的肽碎片数量没有什么变化。 要注意的是，精炼小肽分离时分离度是有限的，可以通过较小的洗脱流速的变化来获得分离度微小的提高。流速也会影响分离的其它方面，比如：检测灵敏度 低流速只能洗脱小量的多肽，吸附与敏感度也因此增加。HPLC窄径色谱柱能提高检测灵明度，这主要是因为它能在低流速下运行，洗脱多肽所用溶剂的量也很小。样品溶解性高流速能提高熟水性多肽的溶解性，虽然这样也会增加纯化该样品的溶剂用量。柱压柱压与流速有直接的关系。流速越大，柱压越高。梯度 流速的变化会影响梯度斜率与峰形，这取决于硬件的配置。由于多肽分离对梯度条件敏感，调整流速会改变其对梯度斜率的影响而改变分离度。温度对肽分离的影响柱温会影响溶剂粘度，柱压和保留时间，也会影响肽的选择性。肽做色谱时温度是一个重要的分离参数。在每个HPLC方法中，应该优化温度分离多肽。如图23所示的是从人生长激素的胰蛋白酶消化物中分离碎片。20oC时，碎片11、12、13几乎同时洗脱。随着温度的升高，碎片13的保留值比碎片11、12要长，所以40oC时这三者的分离度很好。但60oC时，碎片11和12同时洗脱，说明了随温度升高，选择性的变化。在20oC时，碎片15比碎片10洗脱得早，40oC时它们几乎同时洗脱，60oC时碎片10首先洗脱，两者得到很好的分离。这些结果说明了温度对肽选择性的重要影响。温度对肽分离的影响图23.色谱柱：C18, 4.6 x 150 mm 流速：1 mL/min. 洗脱液：梯度渐变 060% CAN+1% TFA水溶液，60 min。 温度：如图所示 样品：人生长激素的胰蛋白酶消化物。 数据来自参考文献39。第八章 用HPLC纯化和分离多肽RP-HPLC在实验室通常来纯化用于研究目的的微克到毫克量的多肽。内径50mm或更大的色谱柱用于纯化克级量的用于临床试验或商业药品的重组蛋白质。实验室内的放大分离通常包括标准溶剂和离子配对试剂或缓冲液的使用、选择所需加样载负特性的柱子尺寸（见附录A）、以及优化洗脱梯度。将实验室分离放大到过程规模，不仅要包括增加柱子的尺寸和洗脱速率，还包括洗脱溶液的变化、不同离子配对试剂或缓冲液的使用、以及梯度条件的变化。在所有情况中，实验室分离的放大可以通过使用用于大尺寸色谱柱的分离材料而得到简化，这些大尺寸柱子和实验室规模常规分离所用柱子的分离特性几乎相同。分离材料的选择产程规模反相分离的材料能得到和分析型反相色谱柱几乎相同的分离特性。VYDAC 300 A的硅胶微粒大小从不到5微米到几乎30微米不等（图40）。通过物理冷上浆来分离5到10微米的微粒碎片，以用于分析和实验室规模的制备分离。VYDAC TP-300 A 孔径硅胶的粒度分布图40.硅胶的粒度从小于5微米到30微米不等，有分析、制备和工艺应用等粒度级较大平均粒度的硅胶，被分离出用于制备和过程放大的应用。过程放大的反相材料与分析规模材料具有几乎相同的蛋白质和肽选择特性，它的加工工艺与分析型大小的硅胶一样，并通过相匹配的化学处理键合在硅胶上。用5、10和15-20微米粒度材料的色谱柱分离几种蛋白质就说明了这一点（图41）。三种柱子的蛋白质选择性和保留时间是一样的。不同微粒大小的材料的唯一不同点是，大分子材料产生的峰更宽，造成分离度有些丢失。大微粒材料10-15、15-20或20-30m通常用于大规模纯化，因为它们比小分子材料便宜，产生柱压低，而且易于装进大直径柱子中。另外，在制备型色谱中，色谱柱几乎总是“超载负”以得到最大样品通量（见43页）。当色谱柱“超载负”时，大微粒材料和小微粒材料的性能差不多，如图42所示。虽然用5或10微米的材料比用在样品低载负时用更大微粒材料得到的峰宽和分离度要好很多（2-3倍），但是在用典型的“超载负”条件进行高进样载负时，峰宽只比用较大微粒材料的大20-50%左右。柱子超载负时，小微粒轻微的分离度的优势并不能弥补其成本高、柱压高以及在工艺应用中的实际困难。不同粒度RP-HPLC色谱柱的蛋白质分离图41.不同粒度反相材料的蛋白质选择性相同，它们之间唯一的区别在于，随着粒度的增加，峰宽增大，分离度降低。 色谱柱材料：A.VYDAC 214TP, 5 m B.VYDAC 214TP,10m C.VYDAC 214TP,15-20m 流动相：24-95% ACN+ 0.1% TFA，1.5 mL/min，30 min放大洗脱条件放大多肽分离时要考虑的三个关键因素是：洗脱溶剂、离子对试剂或缓冲液、以及梯度特性。洗脱溶剂实验室规模的纯化通常使用和分析型色谱一样的有机调节剂，即乙腈。离子对试剂或缓冲液实验室规模的纯化通常使用和分析型色谱一样的离子对试剂或缓冲液。梯度特性增加柱直径时，为了保留分析柱上得到的分离度，必须保持梯度体积的速率为柱体积常数以维持梯度形状。比如，同样长度的直径22mm柱的体积是直径4.6mm柱体积的23倍（22除以4.6，平方）。分析柱以1.0mL/min的梯度走30分钟的体积为30 mL。要把该方法应用到22mm柱上，梯度体积将增加23倍，达690mL。保持梯度时间不变，流速将增加23倍；延长梯度时间，流速也会部分地增加。比如，流速为23mL/min走30分钟，梯度体积为690 mL。但是，以10mL/min的流速走69分钟能得到同样的梯度体积，由此得到同样的梯度形状和同样的样品分离度。在这两种情况下的分离都能与分析柱上得到的相媲美。实际上，梯度常设置得更低即单位时间内有机调节剂浓度增加较小以增加分离度，尤其在收集主要多肽时。不同粒度RP-HPLC材料的蛋白质进样量图42.虽然低进样量时小粒度材料的峰宽很窄，但采用高进样量即色谱柱“超载负”时，峰宽仍没太大变化。 色谱柱材料：VYDAC 214TP,5m；VYDAC 214TP,10m；VYDAC 14TP,15-20 m；VYDAC(R) 214TP,20-30m 洗脱液：24-95% CAN+0.1%TFA水溶液，1.5 mL/min，30min 蛋白质：核糖核酸酶过程放大纯化：多于五克的肽洗脱剂常用于实验室规模色谱的有机溶剂会引起成本、处理或操作环境中的安全等问题。乙醇等溶剂在过程色谱时更适用一些。乙醇相对来说无毒、与水混合时不易燃、成本低并被FDA等管理机构所熟悉。乙醇目前用于大规模过程纯化。离子配对试剂或缓冲液通常用于分析型色谱的离子对试剂不太适用于过程放大色谱。能用于操作色谱的替代离子配对试剂或缓冲液包括乙酸（也能乙酰化多肽，制剂时又用）和磷酸盐。乙酸目前用于几种生物技术多肽治疗剂的分离。梯度特性 根据大柱子而放大洗脱梯度的实验室规模纯化能用于过程放大纯化（见上），多肽洗脱所用梯度通常都很小。一针色谱分析中能纯化多少肽？如果RP-HPLC分离的目的是收集纯化的多肽以备进一步使用，在保持满意的纯度的同时柱子所能载负的样品量就很重要了。制备纯化的方法一般是载负最大可能量的多肽，同时权衡以下三个因素：通量给定时间内纯化的多肽量。虽然低载负产生最大的分离度，但每针色谱分析时纯化量较少，通量也较低。纯度纯度用最终纯化产物的重量占总重量的百分数来表示。纯的多肽通过避免相邻峰的重合来得到，虽然这会限制柱子能载负的样品量。产量纯化后的多肽占初始多肽总量的百分数。最大化分离度可以在除去杂质的同时，回收载负的大部分多肽。如果分离度较低，则收集峰的中间部分，这样就减少了产量。RP-HPLC柱上的样品容量有三个量度： 最佳分离度时的载负容量； 实际样品载负量 柱子允许载负的最大多肽量。最佳分离度时样品载负能力色谱分析中，柱子载负极限通常定义为色谱分析时峰宽增加不超过10%的分析物最大量。对大多数多肽来说，分析柱（直径4.6mm）在到达“超载负”点前，峰宽和分离度保持不变的样品量在100到200g 之间（图43）。 样品载负大于这个值时会形成宽峰，造成分离度降低。核糖核酸酶在分析色谱柱上的进样曲线图43.进样量直到200g时峰宽仍保持不变。大于200g(“超负载”点)时峰宽慢慢变大。核糖核酸酶的实际进样范围是200-5000g。 色谱柱：VYDAC 214TP54 (C4, 5 m, 4.6 x 250 mm) 洗脱液：24-95% ACN+0.1% TFA，30min 样品：核糖核酸酶实际样品载负量制备分离需要通过平衡分离度、产量和纯度来最大化通量。通常来说，提高产量是以减少纯度和降低通量为代价的。在实际中，这往往需要是色谱柱“超载负”也就是多肽进样量多于最佳分离度定义的样品量。随着样品载负增加，多肽的峰宽也随之增加（图43和44），但峰形仍保持对称。这就允许样品载负量可以是定义样品量的10到50倍，而仍能保持可接受的分离度。在图44中，分别进样25、100、200、500和1000微克的核糖核酸酶和溶解酵素，说明了增加样品载负对峰宽增加的分离度的影响。在25和100g的进样量时（在最佳分离度的范围内），核糖核酸酶和它前面的小杂质之间的分离度保持不变（图44A,B）。进样量超过100g（“超载负”点）时，核糖核酸酶和杂质的分离度开始降低。200g进样量时，峰宽明显增加，导致分离度降低（图44C）。500g时，分离度显著降低（图44D）；1000g时，杂质峰与核糖核酸酶的峰完全重合（图44E）。进样量对蛋白质峰形和分离度的影响图44. A. 每种蛋白质25g B.每种蛋白质100g C.每种蛋白质200g D.每种蛋白质500g E.每种蛋白质1000g 色谱柱：VYDAC 214TP54 (C4,5m,4.6x250mm) 洗脱液：25-50% CAN+0.1% TFA，1.5 mL/min，25min 样品：核糖核酸酶和溶菌酶溶解酵素和前面杂质的分离度在200g时仍保持不变，但之后分离度就逐渐减少了。在500g时（图44D）,杂质峰只出现在溶解酵素峰肩上，1000g时（图44E），杂质峰和溶解酵素峰就完全重合了。蛋白质和杂质峰可以通过运行一个更小的梯度提高分离度。由于核糖核酸酶和溶解酵素的分离度甚至在1000g