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分子生物学原理（最终回）Chapter 1 Protein Structure and Function复习题（1）1. 名词解释（1）Peptides 肽，由氨基酸脱水缩合形成的两性有机化合物，相对分子量小于6000（2）Simple proteins 简单蛋白，仅由氨基酸组成，不含蛋白辅助因子等非氨基酸成份的蛋白为简单蛋白。（3）Conjugated proteins 缀合蛋白，除了蛋白组分外还含有蛋白辅助因子等非氨基酸成份（如辅酶、辅基和金属离子等）的蛋白为缀合蛋白。（4）Coenzyme 辅酶，是一种蛋白辅助因子，为非氨基酸成份，通过非共价键与链相连，可以用透析、超滤的方法将其除去。（5）Prosthetic group 辅基，是一种蛋白辅助因子，为非氨基酸成份，通过共价键与多肽链相连，不易与多肽链分离。（6）Configuration 构型，有机分子的空间排列，不同的排列彼此作为参照，具有双键和手性中心两个特征，它们之间的转化需要破坏共价键。（7）Conformation 构象，取代基团的空间排列，由于键的自由旋转，在空间能形成不同位置，它们的转化可以通过单键的旋转来完成，故不需要破坏共价键。（8）Chiral carbin 手性碳原子，连接四个不同原子或基团的碳原子叫做手性碳原子。（9）Enantiomers 对映异构体，如两个分子互为镜像关系，则称这两个分子为对映异构体，对映异构体具有旋光性。 （10）Optical isomers光学异构体，L-和D-构型的异构体具有相同的熔点、溶解度等物理性质和相同的化学性质，但旋光方向相反，故称之为光学异构体（11）Cis and trans isomers 正反异构体，取代基团在双键两侧的不同排列形成正反异构体。（12）Ampholytes两性电解质，既可以作为质子供体又可以作为质子受体的电解质。在偏中性的水溶液中，-氨基酸的氨基（-NH3+）可以起质子供体的作用，而羧基（-COO-）起质子受体的作用，所以氨基酸是两性电解质（13）Isoelectric point 等电点，氨基酸的等电点。当溶液的PH达到某一特定值的时候，氨基酸所带正电荷刚好与负电荷相等，氨基酸分子对外不显电性，此时溶液的PH值。（14）Peptide plane在肽键中，由于共振现象，以致C-N之间具有部分双键的性质，不能自由旋转；而C=O之间具有部分单键的性质。于是，形成肽键的4个原子与其左右相邻的2个C原子处于同一个平面，这两个C反式排列，该平面叫做肽平面。（15）Dihedral angle 二面角，绕C-N及绕C-C旋转的角分别为肽平面的两个二面角，它决定了肽链的主链构象。（16）Ramachandran diagram 拉氏构象图，Ramachandran 根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（、）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，那些是不允许的，并以为横坐标，以为纵坐标，在坐标图上标出，该图即为拉氏构象图。（17）Primary structure of proteins 蛋白的初级结构，氨基酸的排列顺序即为蛋白的初级结构。（18）Secondary structure of proteins 蛋白的二级结构，它是指多肽链的局部构象，即局部骨架的折叠方式, 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸侧链的构象。（19）Tertiary structure of proteins 蛋白的三级结构，是指整条多肽链的构象，包括所有原子的空间排列, 一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置，三级结构的形成和稳定主要靠共价键和次级键来维持。（20）Quaternary structure of proteins 蛋白的四级结构，它是指亚基间的相互作用，包括亚基数目、种类、空间位置及相互作用，但不包括亚基本身的构象，维持四级结构的是次级键。（21）Coiled coil 卷曲螺旋，一种重要的模体，指两个或两个以上的-helix靠疏水性相互作用相互缠绕形成的稳定超螺旋。（22）-strand, -barrel & -saddle折叠链：多肽链骨架呈伸展状形成折叠链；平行排列的折叠片层具有自发的右手扭曲倾向，以减少构象的能量。由于存在自发扭曲和阻碍扭曲（氢键）两种力，如果平行的折叠片段前后交错，则形成漏斗状的圆筒形（barrel）；如果折叠片段矩形排列，就形成马鞍形（saddle）（23）-turn 转角，球状蛋白质的多肽链上出现180的回折即为转角，由四个氨基酸组成，氢键存在于第一个CO和第四个NH之间。一般为trans，但脯氨酸有6%的cis。（24）Disulfide bonds二硫键是多肽链中（或肽链间）的两个Cys残基侧链之间形成的共价键，可以将多肽链的不同部分（或不同的多肽链）连接起来。稳定蛋白质的三级结构。（25）Electronegativity of elements 电负性，为原子获得电子的能力，其数值越大，在形成化学键时对成键电子的吸引能力越强。（26）Entropy 熵，它指的是体系的混乱程度，熵值越大，体系越稳定。（27）Motif 模体，在蛋白质整条肽链中常会出现由数个二级结构肽段在空间上相互靠近，形成固定的局部结构，执行特定的生物功能，这些区域被称为模体，是结构域的亚单元，表现结构域的各种功能。出现在一种或多种蛋白质中（28）Domain 结构域，是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，在三维空间可以明显区分及相对独立，并具有特定的生物学功能。2. 22种天然氨基酸的名称、符号及其主要特征根据氨基酸侧链的性质和在水中的可溶性，可将氨基酸分为三大类：（1）亲水性氨基酸：含有离子型的或极性的侧链。碱性氨基酸：中文名称英文名称缩写符号赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH酸性氨基酸：天门冬氨酸Aspartic acidAspD谷氨酸Glutamic acidGluE极性氨基酸：丝氨酸SerineSerS苏氨酸ThreonineThrT天门冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GlutamiineGlnQ（2）疏水性氨基酸：含有脂肪族侧链，不溶或微溶于水。中文名称英文名称缩写符号丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸ValineValV异亮氨酸IsoleucineIleI亮氨酸LeucineLeuL蛋氨酸MethionineMetM苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW（3）特殊氨基酸：半胱氨酸：Cys的侧链含有活泼的巯基（-SH），通过氧化可以和另一个Cys的侧链形成二硫键（S-S）。甘氨酸：Gly是最小的氨基酸，侧链只有一个氢原子。脯氨酸：Pro是唯一的亚氨基酸，它的-碳原子上的氨基和侧链基团之间共价相连，形成吡咯环，造成C-N键不能旋转。中文名称英文名称缩写符号半胱氨酸CysteineCysC甘氨酸GlycineGlyG脯氨酸ProlineProP（4）第21和22种天然氨基酸：硒代半胱氨酸SelenocysteineSe-Cys吡咯赖氨酸PyrrolysinePyl特征：氨基酸是两性电解质；由于氨基酸侧链不同而导致其在亲水环境中溶解度不同，可分为亲水和疏水两类；部分氨基酸有紫外吸收峰如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸；氨基酸能与茚三酮反映可测定氨基酸的含量；氨基酸之间可进行成肽反映形成肽单元。-NH2 易于和酰化试剂反应，-COOH性质类似于有机酸的羧基。3.举例说明D构型氨基酸的功能？D构型氨基酸参与弧菌消旋酶的形成，影响细菌细胞壁的肽聚糖的形成，所以D构型氨基酸的浓度影响着细菌细胞壁的稳定，从而影响细菌对外界环境的适应能力。4. 为什么Gly的酸性明显强于醋酸？由于在Gly中，-NH2静电排斥-COOH上的H，使COOH中的H更容易解离，故其酸性较强。5. 天然氨基酸的特征性颜色反应和光吸收特征是什么？光吸收特征：1）含有苯环，测定时用280nm的吸光度值（Trp 278nm，Tyr 275nm，Phe 257nm）2）其它氨基酸不含苯环，测定时用220nm的吸光度值，应用的是共轭双键的性质。茚三酮反应：茚三酮和-氨基酸一起加热可以发生氧化还原反应，氨基酸脱去-氨基和羧基，茚三酮被还原。还原产物可以和脱下的氨基在结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，但脯氨酸为黄色，在570nm可见光出现吸收峰，由于吸光度与氨基酸脱氨量有关，可以测定氨基酸含量。氨基酸的-氨基可以和FDNB、荧光胺、丹磺酰氯发生特征性反应，能够显现出不同的颜色，可以定性或定量。6. Peptide bond的主要特点是什么？肽键中N的电子云向羰基O偏移；C-O有40%的单键性质C-N有40%的双键性质，双键性质限制自由旋转；每个残基都保留两个自由旋转的单键N-C和C-C。7. 为什么多肽链具有方向性？多肽链是通过氨基酸的脱水缩合形成，由肽键相连接，由于氨基酸同时含有-NH2和-COOH，这样在多肽链的末端，一端必然有一个游离的-NH2，另一端必然有游离的-COOH，因此肽链就有了方向性。8. -helix和-pleated sheet的主要结构特征是什么？1）-helix一般为右手螺旋，肽平面平行于螺旋的长轴；肽链以螺旋状盘卷前进，每圈螺旋由3.6个氨基酸残基构成，螺距为0.54 nm；螺旋结构被规则排布的氢键所稳定，氢键排布的方式是：肽键羰基O原子和C端方向的第4个残基酰胺H原子形成氢键。由于所有的氢键供体的方向相同，所以-helix具有极性。这样构成的由一个氢键闭合的环，包含13个原子。 氨基酸残基侧链从螺旋形成肽链骨架向外伸出，覆盖在-helix的外表面。由于骨架上极性基团均参与氢键的构成，不再影响亲疏水性，所以亲疏水性完全由残基侧链基团决定。2）每条-折叠链片段比较短，几乎是完全伸展的。侧链交替地分布在片层的上方和下方。在-折叠结构中，相邻肽链主链上的C=O与N-H之间形成氢键，氢键与肽链的长轴近于垂直。相邻肽链的走向可以是平行和反平行两种。在平行的-折叠结构中，相邻肽链的走向相同，氢键不平行。在反平行的-折叠结构中，相邻肽链的走向相反，但氢键近于平行。-折叠链上的每个肽平面基本上和相应的折叠片层平面折叠，氨基酸残基侧链基团交替指向平面的上方和下方。9. 哪些氨基酸残基容易造成-helix结构的不稳定（或终结）？为什么？Pro及Gly。Pro的C原子位于侧链基团吡咯环（刚性环）中，导致C-N键不能旋转，导致-helix在此“打结”或中断。同时，Pro的氨酰基团缺少H原子，不能形成稳定的氢键。对于Gly，由于其C不是手性C，并且由于周围H的存在具有过多的柔性，这样它就形成更多种异变的构象，使肽链骨架发生弯曲，不容易形成-helix。10. Collagen分子结构的主要特点是什么？胶原蛋白（Collagen）由3条链多肽组成，每条多肽链均为左手螺旋构型。三条拧成一股，形成右手超螺旋结构，使其分子结构非常稳定，每圈约为30个氨基酸残基，螺距8.6 nm。胶原蛋白分子中甘氨酸的含量约为35%, 在左手螺旋的单链分子中每三个氨基酸中就有一个甘氨酸，甘氨酸与其它两个氨基酸形成一个单位，反复出现形成了一条单链，三倍体的单链螺旋组成了四级结构为右手螺旋，在三条连中甘氨酸位于链之间的结合位点上，使三条单链紧密结合形成了四级结构，链分子中的Pro/Hyp 使螺旋扭转。11. 第一个完成3D结构测定的蛋白质是什么？何时、何人完成？第一个完成3D结构测定的蛋白是抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin），它是在1957年，由英国的Max Perutz及John Kendrew共同完成的。12. 维持蛋白质分子3D结构的力有哪些？ 维持蛋白3D结构的主要有五种力，分别是氢键、离子键、范德华力及疏水作用力，二硫键13. Hydrogen bond是如何形成的？其本质如何？电负性较大、半径较小的原子与H原子形成分子后，共用电子对强烈偏向电负性较大原子的一边，而H原子核外只有一个电子，其电子云向电负性较大的原子偏移，使得它几乎要呈质子状态。这个半径很小、无内层电子的带部分正电荷的氢原子，使附近另一个分子中含有孤电子对并带部分负电荷的原子充分靠近它，从而产生静电吸引作用。这个静电吸引作用力就是所谓氢键。氢键的本质就是正负电荷的相互吸引。特点:方向性 3个原子在空间位置接近一条直线 180则产生氢键最强，如果有夹角则氢键减弱饱和性 一个供体的H只能被一个受体接受14. Hydrophobic interaction是如何形成的？其本质如何？由于疏水物不是电子极化性的，它们无法形成氢键，所以水会对疏水物产生排斥，当多个疏水性基团存在于水相，这些基团必然相互接近，只有这样才能破坏水分子的笼形结构，增加水分子的混乱度即熵增加。所以疏水性相互作用是一个熵驱动的自发过程，其本质就是熵增加。15. Van der Waals interactions是如何形成的？其本质如何？ 分子间作用力包括取向力，产生于永久偶极诱导力，非极性基团之间的诱导偶极色散力，非极性基团之间，由于电子运动的不对称性，造成电荷密度产生波动，产生瞬间偶极，产生弱的吸引力。范德华力指的是诱导偶极和瞬间偶极之间的相互作用。本质是静电相互作用。复习题（2）1. 名词解释（1）Hierarchical folding model 逐级折叠模型，是氨基酸序列折叠成复杂结构的一种模型，由二级结构折叠成超二级结构，然后形成完整的结构域，最后是整条多肽链的折叠，折叠成具有活性的天然构象。（2）”Molten globule” folding model “熔球折叠”模式，是蛋白质折叠到天然构象的另一种模式，是指伸展的多肽链先形成大量的二级结构单元，但它们之间还未形成稳定的二级结构，接着再通过次级键（主要是疏水键）使二级结构稳定，形成天然构象。（3）Chaperones伴侣分子是一个新发现的蛋白质家族，广泛存在于细胞中，能够结合各种蛋白质分子，可以参与蛋白质的一般折叠过程。两种类型：分子伴侣和伴侣蛋白。（4）Molecular chaperones 分子伴侣，是指结合未折叠的蛋白质和正在合成的多肽，防止其变性，只是间接和部分起作用，如Hsp70（5）Chaperonins伴侣蛋白，是含有三层由7个多聚体组成的桶状结构，能直接帮助多肽链正确地完全折叠的一类蛋白，直接促进蛋白折叠的一类蛋白。（6）Prion disease 朊病毒疾病，该病的致病因子是阮病毒蛋白质，是一种因蛋白质不能正确折叠使构象发生改变导致该病。（7）Ubiquitin 泛素，它是由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽链，通过C末端的Gly，泛素共价地结合于底物蛋白质的Lys残基，被其标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，这种标记作用不具有底物特异性，主要功能是与蛋白质结合后，使之降解，或参与DNA损伤修复、内吞、免疫应答等。（8）Ubiquitination 泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程。泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应：首先在ATP供能的情况下，酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素；接着，E1将激活的泛素分子转移到E2酶上；随后E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白，对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例可以分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰（9）Pupylation 原核中的“泛素化”，即PUP蛋白与靶蛋白Lys残基侧链的连接，介导原核蛋白的降解。（10）protein denaturation 蛋白变性，蛋白质在某些物理和化学因素（一般可通过加热、辐射、加压等物理因素，也可加入乙醇、酸、碱及变性剂等化学试剂）作用下其特定的空间构象被改变，即其三级结构的改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。（11）Renaturation 复性，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性。（12）3D domain swapping 即三维结构结构域交换，在特定的单体之间交换特定的结构元件产生的聚合结构单元,是产生多聚化的重要模式，使相同亚基之间聚合。例如人的朊蛋白，PrPSC+PrPC2PrPSC（13）Intrinsically unstructured proteins（IUP）内在未折叠蛋白，在中性pH条件下，一种蛋白的伸展结构，表现出高度的可变性并缺乏二级结构单元，它包括几乎完全不折叠和局部不折叠蛋白两类（14）Integral proteins 内在蛋白，膜蛋白的一种，其疏水部分与膜磷脂疏水部分共价连接，两端具极性，蛋白贯穿膜内外，含有膜外部分和膜内部分。大多可通过加入去污剂而释放出来。（15）Peripheral proteins 外在蛋白，膜蛋白的一种，不直接与膜疏水性双分子层相连接，通过氢键、离子键与脂分子或膜蛋白结合，周边膜蛋白，大多以共价键与膜结合，不含膜内部分，大多可通过改变离子强度、加入螯合剂、尿素或碳酸盐可从膜上释放出来。（16）Sedimentation coefficient 沉降系数，在单位离心力场中粒子移动的速度，是以时间表示，跟颗粒大小与密度有关，在一定温度和介质中描述微粒在离心场中运动特征的常数，与微粒的密度、形状相关，与密度和质量成正比（17）Differential centrifugation 差速离心，是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的，将可溶性成分与不溶性成分区分开来。（18）Rate-zonal centrifugation 速率区带离心，不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。先使惰性介质形成密度梯度，再加入样品，利用可溶性物质质量的差异，经过离心，将混合物分成质量不同的若干区带的分离方法（19）Ion exchange chromatography 离子交换色谱，是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来分离溶液中带电离子的一种方法，凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其原理是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现，分离利用不同蛋白质组分在一定PH的缓冲液中所带的净电荷不同，与固定相（离子交换树脂）上的键合基团发生离子交换后，利用不同盐浓度或PH的缓冲液将不同组分从固定相上洗脱下来，达到分离目的的一种层析方法（20）Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析，又称分子筛，主要是根据蛋白质的大小和形状及蛋白质的质量进行分离和纯化，条件温和，回收率高（大分子先出，小分子后出）。利用树脂内部形成的网状结构，蛋白混合物中分子量小的蛋白颗粒进胶，后洗脱，分子量大的组分不进胶，而被先洗脱，是利用蛋白质分子量大小不同的性质进行分离的方法。缺点是样品量受限，样品体积小于5%柱体积。（21）Affinity chromatography 亲和层析，利用某些分子间能特异性吸附和释放而建立的一种层析分离技术，主要用于抗原或抗体的纯化制备。利用蛋白质生物学活性不同，使具有某种生物特性的蛋白与树脂上键合的相应基团结合，而其它蛋白不结合，最后用竞争性洗脱剂将该蛋白洗脱下来而达到分离的方法（22）Specific activity 比活性，指每毫克总蛋白的酶活性单位。酶的总活性/总蛋白量（units/mg），可用于酶纯度的衡量（23）HPLC 高效液相色谱，其原理是被测不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质按顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质，具有分离速度快，灵敏度高，分辨率高等特点。有两个主要特点：（1）树脂颗粒很细，以增加有效交换面积，进而提高分离效率；（2）由于树脂颗粒很小，流动相必须借助于高压泵才能获得正常流速。（24）Reverse Phase HPLC 反相高效液相色谱，这是一种固定相极性小于流动相极性的液相色谱，极性大的先流出。与正向色谱相比，反相色谱的固定相极性流动相，固定性吸附了一层极性小的液膜，这样极性大的组分先被洗脱，而极性小的组分后被洗脱的一种HPLC（25）FPLC 快速蛋白液相色谱，专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，其原理与经典的HPLC相似，使用了惰性材料，只是所有接头、阀门、管道系统和层析柱均采用惰性材料如：钛和塑料，可确保工作状态下生物分子的活性不受影响（26）Perfusion chromatography 灌注色谱，使用了新的HPLC树脂，使样品与固定相作用加快，并且保持了较高的灵敏度，其原理与HPLC相同。采用一种新型层析树脂的HPLC，该树脂具有穿透孔大，便于流动相将样品快速带入树脂内部的扩散孔，而扩散孔短小，在保证灵敏度不变的前提下，可大大提高流速降低层析时间。2. 1950s，著名的C. Anfinsen实验的内容和意义是什么？RNase A（含124个氨基酸，4个二硫键）在8M尿素及巯基乙醇的作用下变性，不能再水解RNA，但当变性剂除去以后，RNase恢复了原有的构象，能够将RNA水解。其意义是首次证明了蛋白质的一级结构与高级结构的关系，蛋白质活性（高级结构）由其一级结构决定。3. 举例说明Covalent modification of proteins的主要类型。Ser、Thr及Tyr的磷酸化；Lys的甲基化；Lys的乙酰化；Cys的烷基化；Lys的泛素化；Ser及Thr的N-乙酰胺基葡萄糖化（N-acetylglucosamine）。如P53蛋白，N末端的磷酸化修饰，C末端的乙酰化、泛素化及SUMO修饰；组蛋白N末端前20个氨基酸甲基化、磷酸化和乙酰化修饰；IgG的Fc端的糖基化修饰等等4. 说明Ubiquitin-mediated proteolytic pathway的主要过程。（1）泛素的活化：泛素Gly端的羧基连接到泛素活化酶E1的巯基，这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和E1之间的硫酯键。 （2）E1通过交酯化过程将活化后的泛素交给泛素结合酶E2。 （3）泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白上，当蛋白上已经存在泛素的时候，结合了E2的泛素可以直接连接在其上而不通过E3。 最终，被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。5. 实验室常用的蛋白质变性剂有哪些？其原理如何？常用的变性剂有：尿素、盐酸胍，这两种都是具有很强的竞争氢键能力，从而打破二、三级结构间的氢键而使蛋白变性；-巯基乙醇、DTT是巯基还原剂，可还原蛋白质内部的二硫键而使蛋白变性。6. 蛋白质分子的三维结构是否完全取决于它的一级结构？不是完全取决于它的一级结构，在体外有相似序列的蛋白质也有相似的折叠结构，但是在体内蛋白的折叠非常复杂。所以说，蛋白质的基本结构信息是由序列编码的，但是为了折叠形成正确的结构，还需要其他辅助因子的参与。其存在的周边环境和其它因素对蛋白质的三级结构的形成也有影响，如是否有伴侣分子、水分子的作用等等。7. 蛋白质分子是否只能折叠成一种特殊的三维结构？ 不是只能折叠成一种特殊三级结构，如乳铁传蛋白因是否与配体结合而具有两种天然构象。有的蛋白与不同大小的底物结合就具有不同的天然构象，有的蛋白形成二聚体或多聚体时，单体的构象会发生转变，有的蛋白能形成比例不一的两种天然构象。（1）当蛋白质与配体结合时，会发生构象改变，这对于蛋白质功能有重要作用。（2）独立的结构域的结构不变，但是相对位置会发生改变。（3）在两个结构域之间的接触面附近形成铰链。8. Intrinsically unstructured proteins有哪些特征（结构、功能）？结构：（1）内源非结构蛋白含有501827个氨基酸残基；（2）亲水氨基酸含量高，疏水氨基酸含量低，所以具有较高净电荷和较高亲水性；（3）Pro/Lys/Glu含量高，而芳香族氨基酸含量低。功能：非结构蛋白质具有超过30种功能：（1）与信号转导、细胞周期调控和基因表达密切相关；（2）与DNA结合，促进转录、转座、组装、修复和复制；（3）和转录后修饰位点结合；（4）在RNA和蛋白质分子伴侣中普遍存在。非结构蛋白的功能优势：（1）在发挥调控功能和与配体结合时可塑性更强；（2）能够与多种不同的配体结合；（3）有较大的分子间接触面；（4）Overall smaller protein genome and cell sizes9. 何谓酶蛋白的Km值？如果改变浓度，Vmax和Km值是否改变？米氏常数，是酶促反应的重要参数，表示酶与底物的亲和能力，以1/2Vmax时所需的底物浓度来表示。改变酶浓度，Vmax改变（Cm增加，Vmax增加；Cm降低，Vmax降低；），但Km值并不随酶浓度的变化而变化10. 离心法分离纯化蛋白质的原理是什么？离心主要是根据物质的质量或密度不同，由于蛋白的密度差别较小，主要根据其质量不同进行离心。离心的原理是，如果两种微粒或分子处于悬浮状态，其质量或密度不同，它们将以不同的速度沉降到试管的底部。而蛋白质在质量上变化很大，而不在密度上。蛋白质密度的平均值为1.37g/ml，除非蛋白质附着于脂类或多糖，否则其密度与平均值的差别不超过15%。较重的蛋白质分子沉降速度较快，经过一段时间在试管底部聚集成一小团，而上清液含有未沉淀的蛋白质分子。11. 在细胞裂解液中，沉降系数最大的组分是什么？密度最大的组分是什么？沉降常数最大的是细胞核，密度最大的是RNA12简单模体的折叠规律？至少由2个二级结构组成，一般为螺旋和转角，往往折叠在2个层面上多肽片段一般在一级结构相互靠近，也有相隔远的片段相互靠近二级结构片段之间的连接不能跨越-sheets在右手螺旋时是最稳定的 复习题（3）1. 名词解释（1）Free electrophoresis 自由电泳，溶质在自由溶液中的泳动为自由电泳，分辨率较低。利用液体介质，在U型管的两端施加直流电场进行蛋白分离的一种电泳方法，又叫移动界面电泳（2）Zone electrophores 区带电泳，带电粒子在固相介质中通过电泳而分离的一种方法，固相支持物有滤纸、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等。（3）Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在过硫酸铵和TEMED的作用下聚合形成一定网状结构的聚丙烯酰胺凝胶，有分子筛效应，以此为介质，进行的电泳。用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。（4）Sodium Dodecyl Sulfate （SDS）十二烷基硫酸钠，常用于蛋白变性，是一种去垢剂。十二烷基硫酸钠 是一种电泳中常用的试剂，它具有很强的疏水性，可破坏蛋白质的三级和四级结构，使蛋白质的多肽链比较伸展；由于其带的负电荷是多肽链的10倍以上，因此蛋白质经SDS处理后，基本上消除了各组分在电荷和形状方面的差异，使蛋白的运动速度仅取决于分子量大小。（5）SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺为固相支持物的电泳，其中，SDS使蛋白带有相同的表观电荷，根据蛋白分子量的不同，使蛋白分离。在制备PAGE凝胶和处理样品时加入SDS，使蛋白质在电泳时，多肽链的长度（质量）成为其迁移率的唯一决定因素的电泳，SDS-PAGE可以通过比较待测蛋白质和标准蛋白质的相对迁移率，计算待测蛋白质的相对分子质量。（6）Isoelectric focusing electrophoresis（IEF）等电聚焦，根据蛋白质的等电点不同进行分离。其原理是，在聚丙烯酰胺凝胶中含有两性电解质形成的稳定而连续的线性pH梯度，在电泳中蛋白质分子迁移到pI=pH的位点时就停止前进，于是，pI不同的蛋白质分子将分别聚焦在相当于各自pI的位置，形成一条条狭窄的区带。（7）Two-dimensional electrophoresis先后利用电荷与质量的差异分离蛋白质。首先将蛋白混合物在含有两性电解质介质的玻璃管中进行IEF电泳，令蛋白质按pI不同分离；然后将凝胶条取出，很放在另一块平板凝胶上进行SDS-PAGE，电泳方向与IEF电泳垂直，使蛋白质分子再根据质量大小分离。双向电泳分辨率很高，而且重复性好，可用于研究分化细胞中不同基因的表达。（8）Capillary electrophoresis 毛细管电泳，电泳在石英毛细管中进行，毛细管内充满缓冲液或凝胶，毛细管的散热效率很高，而电阻较大，电流较小。外壁涂有一层聚酰亚胺，有一定的柔韧性，不易折断。利用毛细管中被分析的带电分子在电场作用下，因移动速率不同而达到分离不同分子的目的。具有高效，快速，微量，高压的优点。（9）Edman degradation Edman降解 是瑞典科学家Edman发明的一种测定蛋白质一级结构的一种方法：偶联：PICT（异硫氰酸苯酯）结合于多肽链N末端的游离-氨基，大大削弱了连接第一和第二个氨基酸残基的肽键；裂解：利用酸（无水三氟乙酸）将N末端氨基酸残基切割下来，形成环形的ATZ-氨基酸和少了一个残基的多肽链，后者可重复进行下一个循环的偶联和切割；转化：ATZ-氨基酸不稳定，在酸性条件下可转化成稳定的PTH-氨基酸；鉴定：通过HPLC、气相色谱、薄层层析和质朴等多种方法，均可鉴定每个循环产生的PTH-氨基酸，从而获得氨基酸残基的排列顺序。（10）Mass Spectrometry （MS）质谱，质谱分析是一种测量离子荷质比的分析方法，其基本原理是使各组分发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。（11）MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间。MALDI的原理是，用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，从而使生物分子电离，是一种软电离技术。TOF的原理是，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而对离子进行检测，即被测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。可克服普通MS不能测定大分子蛋白质量的问题（12）ESI MS 电喷射电离质谱，是将液相的蛋白质样品通过一个高压电喷射针快速气化成小颗粒，并电离再进行MS分析的一种方法，也可克服不能测定大分子蛋白质量的问题（13）Solid-phase peptide synthesis固相多肽合成 是一种先将C端第一个氨基酸用t-Boc保护其-氨基再将其羧基键合在惰性固相树脂上，去除氨基保护，将下一个要合成的氨基酸保护-氨基活化其-羧基，再与键合到树脂上的氨基酸生成肽键，由此循环，最终合成所需多肽链的方法。其合成方向为C到N（14）Proteome 蛋白组，细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质，包括不同环境、不同状态或不同发育阶段蛋白质水平的变化。（15）Proteomics 蛋白组学，是研究生物各种基因组在细胞和组织中表达的全部蛋白的分子结构、功能及其相互作用的新学科，旨在发现高疗效、低副作用的新药。（16）X-ray crystallography X射线晶体衍射，用于分析蛋白质分子的三维结构。当X射线穿过蛋白质晶体时，蛋白质分子中的每个原子使X射线发生散射，可以在感光胶片上产生不连续的衍射斑点。X射线晶体衍射结构分析，主要依据衍射线的方向和强度。前者通过Bragg方程进行计算，可以确定每个晶胞的大小和形状；后者需要测出晶胞体积、结构振幅和相角，在通过分布函数计算出晶胞中的电子云密度分布，画出电子密度图，才能确定晶胞中原子的分布，进而建立蛋白质分子的三维结构（17）Southern blotting Southern DNA印记法，迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。首先分离消化的DNA片段，将其变性并在原位将单链DNA片段转移至固相支持物上，固定后用相对应的探针标记，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的位置。（18）Northern blotting RNA印记法，是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，用来衡量真核生物RNA的量和大小，及估测其丰度的一种方法。2. 第一个完成一级结构分析的蛋白质是什么？是哪位科学家何时、如何完成的？1955，Frederick Sanger利用FDNB和纸层析完成了第一个蛋白质分子，牛胰岛素的一级结构分析。3. 简述分析蛋白质分子一级结构的基本方法（策略）。以大化小，分段去测，最后拼接。最关键是选择裂解手段，取决于氨基酸的组成，每种氨基酸的摩尔比，选择特异性强效率高的方法进行裂解，裂解成小于50个氨基酸的小段，放入氨基酸测序仪进行测序，使用两种方法将多肽链转移性裂解，逐一测定每个纯化的小肽段的顺序，然后根据这两套肽段氨基酸顺序中的重复区确定小肽段的排列次序，从而完成整条多肽链的顺序分析。4. 简述用ESI MS/MS进行Protein sequencing的基本过程。（1）将待测蛋白质溶液用酶或化学试剂处理水解成短肽混合物，注入MS-1中；（2）在MS-1中电离作用下，短肽发生断裂，只选取其中的一种肽段进一步分析；（3）在两级MS之间的碰撞室中，He或Ar等惰性气体破坏肽键，而使肽段进一步裂解形成离子片段，（4）在MS-2中对离子片段进行分析，测量荷质比，从而确定每一个氨基酸片段。最后得到整条多肽链的氨基酸序列。5. 简述Solid-phase peptide synthesis的基本步骤。（1）通过酯化反应，将第一个氨基酸分子的羧基（-COOH）共价连接于不可溶的固相树脂，其氨基（-NH3）被tBOC基团所保护；（2）利用三氟乙酸去除tBOC基团，-NH3去保护；（3）在DCC作用下，第一个氨基酸的氨基同第二个氨基酸的羧基缩合成肽键（后者的氨基也被tBOC基团保护），形成二肽；（4）重复上述过程，于是一个个氨基酸从C端一次连接到不断延伸的肽链的N端，直到合成的肽链长度符合要求，最后利用HF将产物从树脂上切割下来，并除去氨基酸侧链上的保护基团。6. 研究3D structure of a protein的基本方法有哪些？ 晶体：X射线晶体衍射图谱法、中子衍射法；溶液：核磁共振法、圆二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法、氢同位素交换法。7. 与X-ray crystallography法测定测定蛋白质三维结构相比，NMR spectroscopy法的两个显著特点是什么？可以在溶液中进行，不需要制备蛋白晶体，能测定的蛋白质分子量较小，只能测定分子量小于40KD的蛋白，而X射线晶体衍射可测定大到8500KD的蛋白8. 简述Western blotting（immunoblotting）的基本过程。利用SDS-PAGE电泳分离蛋白混合物，接着通过电印迹法将将蛋白质转移到PVDF膜（或NC膜）上，将点转移后PVDF膜浸泡在含有目的蛋白特异性抗体Ab1中，仅含有目的蛋白的区带结合了一层Ab1，洗去多余的Ab1，加入酶标二抗Ab2，它将特异性与Ab1-目的蛋白复合物结合，洗去多余的Ab2，加入显色酶底物，含有目的蛋白的区带将显示特殊的颜色，从而确定目的蛋白的位置Chapter 2 Catalytic Strategies1. 名词解释1） Transition state 过渡态，在反应过程中，反应能量最高、最不稳定的形式，该状态化学键正在断裂或形成。2） Activation energy活化能。过渡态和基态之间的自由能差。活化能越大，反应越难发生，降低活化能，可以提高反应速率。3） binding energy 结合能，酶促反应耗能，酶-底物之间通过次级键相互作用，每个次级键的形成均释放少量自由量，这种酶-底物相互作用产生的能量的总和就是结合能。4）Induced fit 诱导契合，酶-底物结合时，酶蛋白通常表现结构柔性，即结构发生重排，构象发生改变，即为诱导契合。其原因在于功能基团获得必要的空间取向，增强特异的催化能力，形成和稳定过渡态。5）Nucleophiles 亲核基团，通过贡献电子而与反应物成键的化学基团为亲核基团。带负电性的基团，倾向于和正电荷结合，发生亲核攻击6）Electrophiles 亲电基团，通过得电子而与反应物成键的化学基团为亲电基团。带正电性的基团，倾向于和负电荷结合，发生亲电攻击7）General acid-base catalysis 一般酸碱催化，通过某种反应增加反应基团的亲核性或亲电性的催化反应，最常用的方式是通过质子转移。8）General acid，General base一般酸，能够释放质子的任何物质。常见的一般酸有：COOH、NH3。一般碱，能够结合质子的任何物质。常见的一般碱有：COO、NH2。9）The catalytic triad 催化三联体，糜蛋白酶活性中心195位的Ser，57位His，102位Asp三个氨基酸残基形成的，对蛋白催化起重要作用,一起作用破坏肽链中的肽键。由于酶折叠成复杂的三级结构，酶的催化位点离的较远，但这种三联体的结构使它们彼此靠近。10）The oxyanion hole在糜蛋白酶催化底物肽键断裂的第一阶段（酰化），Ser195的羟基侧链将质子传递给His57以后，亲核能力大增的氧原子攻击敏感肽键的羰基碳原子，使这个羰基变成单键，并且羰基氧原子因获得一个负电荷而成为氧负离子（oxyanion）。这个氧负离子和酶肽链骨架的两个酰胺基团（来自Ser 195和Gly 193）之间产生氢键，形成氧负离子穴。11）Divergent evolution 趋异进化，有些生物或者某些蛋白虽然同出一源，但在进化过程中在不同选择压力的作用下变得很不相同，这种现象称为趋异进化。12）Convergent evolution 趋同进化，不同的生物或蛋白，甚至在进化上相距甚远的生物或差异较大的蛋白，在同样选择压的作用下，产生功能相同或十分相似的形态结构，以适应相同的条件，此种现象称为趋同进化。13）Restriction-Modification systems 限制修饰体系，是细菌或其它原核生物用来防止噬菌体或外源DNA侵入的机制。限制性内切酶只识别、切断外源片断，对自身序列不能切割。因为自身的腺苷酸被甲基化修饰，形成保护，不被切割14）P-loop P环，是一个ATP结合位点的模体，存在于核苷酸结合蛋白中，是一个柔性环，一般由Gly-X-X-X-X-Gly-Lys组成。2. 结合能在酶促反应中有什么重要意义？ 结合能增加酶-底物相互作用的稳定性，降低活化能和稳定过渡态，并克服了4个热力学障碍：熵减；去溶剂化；底物变形；功能基团空间定位。3. 酶催化的5种基本机制是什么？结合能；共价催化；一般酸碱催化；金属离子催化及邻近催化。4. 金属离子在酶促反应中起什么作用？ 金属离子通过三方面在酶促反应中起作用：充当亲核电子的催化剂；通过提高临近分子的酸性产生亲核基团（如碳酸酐酶）；与底物结合故此产生结合能（如NMP激酶）。5. Ser蛋白酶的催化机制是什么？催化机制：通过位于活性中心丝氨酸残基侧链上的羟基，对底物蛋白的敏感肽键进行亲核攻击。丝氨酸蛋白酶催化底物肽键断裂主要有酰化和去酰化两个阶段。酰化：（1）底物多肽进入酶的活性中心，形成酶-底物复合物；（2）Ser195的羟基侧链将质子传递给His57以后，亲核能力大增的氧原子攻击敏感肽键的羰基碳原子，使羰基变成单键，并且羰基氧原子因获得一个负电荷而成为氧负离子。（3）这个氧负离子和酶肽链骨架的两个酰胺基团（来自Ser 195和Gly 193）之间产生氢键，形成氧负离子穴。这时，以敏感肽键羰基碳原子为中心形成四面体过渡态。（4）质子化的His57将质子传递给底物敏感肽键的氮原子，造成肽键断裂，所产生的氨基部分以氢键同His57结合，迅速扩散；而酰基部分和Ser195以酯键结合，生成酰基-酶共价中间物；去酰化：基本上是上一阶段的逆反应，但水分子取代了酰化产生的氨基部分。（5）His57从水分子吸收一个质子，所产生的OH-立即亲核攻击连接酰基-酶中间物的羰基碳原子；（6）又形成短暂的四面体过渡态；（7）释放出底物的酸性部分，酶恢复原状。6. 几种Ser蛋白酶，如糜蛋白酶、胰蛋白酶及弹性蛋白酶它们识别底物有何异同，为什么？相同点：3个酶都存在Asp 102-His 57-Ser 195的催化三联体来完成催化，都具有氧负离子穴组成的口袋。1） 3个氨基酸顺序有40%的相同，特别是活性部位Ser 195周围的氨基酸序列相同；2）相似的构象；不同点：3个酶与底物结合的部位不同：糜蛋白酶的口袋由非极性氨基酸组成，较宽，结合大的疏水侧链；胰蛋白酶口袋底部的残基是带负电的Asp 189，可结合带正电的氨基酸；弹性蛋白的口袋具有Val 126和Thr 226，可防止大侧链的氨基酸进入，只允许小的氨基酸进入“口袋”。7. 碳酸酐酶使用什么催化机制使CO2的水和反应如此快速进行？主要机制：结合能，金属离子催化，特殊酸碱催化和一般酸碱催化。作用机理：（1）Zn2+与3个His和1个H2O结合，促进水分子去质子化，生成OH-；（2）CO2与酶的活