白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究开题报告.doc

白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究开题报告 开题报告白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究选题的背景意义 白蔹又名白根五爪藤山地瓜始载于神农本草经性微寒味苦1中华人民共和国药典2005版收载的白蔹为葡萄科白蔹 Ampelopsis japonics Thunb Makino 的块根2 白蔹原产我国的华北华东和中南等省区喜温暖湿润和阳光充足的环境也耐荫耐贫瘠和干旱耐寒冷但怕积水白蔹块状茎具有清热解毒消痈散结生肌止痛之功效可用于治疗痈肿疮疡瘰疬烫伤扭挫伤等外用也可用于痈疖蜂窝组织炎淋巴结炎等病症常作药用植物栽培近年将其作为观赏花卉引种栽培3 白蔹入药历史悠久早在名医别录中已有记载是历代医家治疗疔痈的重要药物4-5药理实验研究表明白蔹的主要活性为抗菌性许多新活性如免疫调节活性及抑制毛发生长作用等不断被发现但是多数药理活性研究还处于初级阶段其真正起作用的物质尚未阐明需进一步研究 目前从植物中寻求抗肿瘤活性物质现已成为抗癌药物的重要研究内容6例如紫杉醇黄连升麻等中药化合物在临床上已经广泛被使用本次实验研究白蔹的抗肿瘤活性其相关方面的研究甚少针对三种萃取物对HeLa细胞人宫颈癌细胞的抗肿瘤活性研究还未见有相关报道因此本次实验的开展一方面为白蔹各种剂型的开发提供理论依据另一方面也为进一步探索白蔹的药理活性打下基础 二相关研究的最新成果及动态 21 白蔹化学成分研究进展 现代研究发现白蔹经5乙醇渗漉提取后根据理化性质及光谱分析鉴定其化学成分为大黄素甲醚羽扇豆醇p-谷甾醇大黄酚碳十六酸大黄素富马酸胡萝卜甙没食子酸卫茅醇大黄素甲醚大黄酚大黄素富马酸没食子酸具有抗菌和抗真菌作用这与中医药关于白蔹的临床应用相一致7 为了进一步阐明白蔹的化学成分为白蔹的深层开发提供依据郝军等8从白蔹的乙酸乙酯萃取液中分离得到了8个化合物利用理化常数和波谱学方法1HNMR13C-NMR鉴定了它们的结构分别为没食子酸原儿茶酸龙胆酸白藜芦醇大黄素羽扇豆醇p一谷甾醇胡萝卜甙 郝军等2又从其氯仿和乙酸乙酯萃取部分中分离得到了五味子苷 大黄酚 大黄素甲醚大黄素-8-O-D-吡喃葡萄糖苷 poriferast-5-en-3 7-diol棕榈酸齐墩果酸 目前所见的研究大多数是从氯仿乙酸乙酯等溶剂中萃取分离白蔹中的化合物22 白蔹的应用221 白蔹的药理作用 1抗菌活性 抗菌是白蔹的主要活性目前研究的较多白蔹含有大黄素甲醚大黄酚大黄素富马酸没食子酸等多种抗细菌和真菌成分与其临床应用相一致白蔹的水浸液对同心性毛癣菌奥杜盎氏小芽胞癣菌腹股沟和红色表皮癣菌等真菌有不同程度的抑制作用水煎剂用平板稀释法对金黄色葡萄球菌有抑制作用6 将蛇葡萄根白蔹等4味中药的70 乙醇提取物制成外用蛇葡萄根霜剂体外抑菌实验表明此霜剂对金黄色葡萄球菌大肠杆菌铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用5口腔微生物通过腐败消化口腔内的滞留物质产生挥发性硫化物及其它异味物质导致口臭朱彩莲等9通过测定挥发性硫化物发现白蔹对临床采集的牙周病口臭患者唾液细菌的抑菌率为45 2抗肿瘤 白蔹的甲醇提取物及从中提取纯化的momordin对激活蛋白AP-1活性及肿瘤细胞的增生有抑制作用momordin 对肿瘤细胞的抑制活性最强其IC50 为228 mgml白蔹的甲醇提取物和momordin还对人肿瘤细胞有细胞毒作用momordinI细胞毒作用最强IC50 为 72801605 mgml10-11Kim 等11研究了momordinI 对白血病HL-60 细胞的细胞毒作用其IC50 为190 mgml并证明其作用机制是通过降低Bcl-2Bax的比例及激活caspase-3诱导了白血病HL-60 细胞的凋亡 许多中药乙醇提取物均有高度酪氨酸酶抑制作用能阻截皮肤中黑色素的形成唐海谊等9发现白蔹水提物对酪氨酸酶有很强的抑制作用 3免疫调节活性 动物实验表明123 种不同剂量的白蔹醇提物51020 gkg对小鼠外周血淋巴细胞ANAE阳性率T细胞增殖能力及巨噬细胞吞噬功能均有促进作用并随剂量增加作用增强量效呈正相关作者认为白蔹提取物可增强小鼠T淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能表明白蔹的抗菌作用与其免疫活性有关临床用于抗感染治疗可能具有直接抗菌和调节集体免疫功能的双重机制 4兴奋作用 赵翠兰13观察了白蔹煎剂对小鼠给药前后电刺激的痛阈变化发现白蔹煎剂对小白鼠有一定的兴奋作用无镇痛作用 5抑制毛发生长 白蔹的水煎剂对小鼠触须毛囊生长有明显抑制作用222 白蔹的临床作用 白蔹属于清热解毒药苦辛微寒归心胃肝经苦寒能清热解毒味辛能散结消痛外用可敛疮生肌可用于疮痈肿毒烧烫伤既可内服又可外敷 白蔹的临床应用有治疗癌性发热治疗支气管扩张咯血治疗手足皲裂治疗烧伤治疗骨折等 课题的研究内容及拟采取的研究方法技术路线难点及预期达到的目标31 研究内容及其目标 本课题是对已获得的三种白蔹提取物进行体外抗肿瘤活性实验探究白蔹的抗肿瘤能力并比较三种萃取物的抗肿瘤活性能力大小32 采取的研究方法 对Hela细胞人宫颈癌细胞进行培养至最佳状态拟采用MTT法测三种萃取物对癌细胞的抑制能力计算和比较各萃取物的IC5033 课题的研究难点 虽然实验步骤不多但细胞培养需要有认真负责的心态每天都要观察细胞状态并做出相应的处理直到把细胞状态调到最佳方能进行实验对操作者的无菌操作能力要求比较高而MTT实验需要大量的重复实验要科学客观的分析每一次的实验数据缩小并最终确定有效的药物浓度范围34 实验方案341 材料和仪器 Hela细胞人宫颈癌细胞培养皿NEST倒置生物显微镜Nikon全自动酶标仪 Model 680型 美国 BioRad 公司二氧化碳培养箱日本三洋电热恒温水浴锅上海精宏酒精灯50mL离心管Corning血球计数板上海安信等342 试剂 RPMI1640培养基HycloneRPMI1640双抗溶液SigmaMTTSigmaDMSO溶液SigmaPBS缓冲溶液BOSTER025胰酶溶液Hyclone新生胎牛血清四季青343 药物 白蔹的石油醚萃取物乙酸乙脂萃取物正丁醇萃取物344 方法 细胞培养 Hela细胞人宫颈癌细胞由华东师范大学生命医学研究所提供将Hela细胞培养于RPMI1640 完全培养基中 每2天换液1次 每3天传代1次细胞置于37 5CO2 饱和湿度的培养箱中 取对数生长期细胞用于实验 单层培养细胞单细胞悬液的制备 弃去培养细胞对数生长期中的培养液加入34mL PBS液漂洗弃去PBS再加入8001000L 37胰蛋白酶倒置显微镜下观察见细胞稍变圆时加入12mLRPMI1640完全培养基停止胰蛋白酶消化细胞作用最后用吸管反复吹打使其分散为单个细胞悬液 3细胞接板及加药 取肿瘤细胞悬液用血球计数板计数调整细胞悬液浓度至5104个mL不断打匀并接种于96孔细胞培养板每孔加入100L细胞悬液使得每孔细胞数为5000个小心轻放96孔培养板置培养箱温育375CO2饱合湿度待细胞贴壁后 吸净培养基每孔加入98L完全培养基和各稀释度药物2L使得药物终浓度为10-1mgmL10-2mgmL10-3mgmL10-4mgmL10-5mgmL根据具体需要调整浓度再平行设空白对照组2LDMSO加98L培养基以上各浓度和对照组均重复5个孔 4加MTT测定 将MTT粉末在避光下用PBS缓冲溶液配制成5mgmL的母液避光保存在-20冰箱中待用 加药24h后小心取出96孔培养板吸去培养基尽量吸干净在避光条件下每孔加入90L空白培养基 和10L5mgmL MTT溶液继续培养4 h小心取出板吸尽上清液 每孔加入150L DMSO再设三个本底对照孔只加150LDMSO 不断振荡充分溶解MTT紫色还原产物置酶标仪上于490 nm 波长处测定各药物组空白对照组和本底对照组的光密度 OD 按公式计算得到药物对肿瘤细胞生长的抑制率 IR 和半数抑制浓度 IC50 14-15 并对药效进行初步的评价 IR 1- O D加药组-ODDMSOO D对照组-ODDMSO100四论文详细工作进度和安排2010112-2010122 熟悉基本实验操作开题相关资料的搜集和文献综述的写作 2010123-20101220 Hela细胞人宫颈癌细胞培养和化合物的陪住20101221-201111 MTT法初试确定有效的药物浓度范围201112-201121 缩小测试浓度范围分别计算出各萃取物对Hela细胞的IC50201122-2011324实验数据处理和论文写作2010531完成并提交毕业论文201065 在学校指定时间进行毕业论文答辩201067 完成并提交答辩后的修改论文参考文献1 林慧君陈卫白蔹多糖PAJM-的分离纯化和结构分析J 海峡药学2008204102-1042 赫军畅晓兵杨旭 白蔹的化学成分J 沈阳药科大学学报2009263188-1903 兑宝峰 药用花卉-白蔹J FLOWERS2008112188-1904 季宇彬 抗癌中药药理与应用M哈尔滨黑龙江科学技术出版社1999446-4475 Kim JHJu EM Lee DKHwang HJInduction of apoptosis by momordinI in promyelocytic leukemiaHL-60cellsJAnticancer Res2002223 1885-18896 李洪娟张蕾王术光白蔹的药理作用及临床应用J食品与药品200791060-627 邹济高金蓉鸾何宏贤白蔹化学成分研究J中药材200023290-938 赫军羡冀等白蔹化学成分研究IM沈阳沈阳药科大学学报2000441-4449 唐海谊何冠邦周喜林 美白中药之水及乙醇提取物对酪氨酸酶抑制功效之比较J 中国药学杂志2005405 342-34310 Lee D KKim BLee S Get alMomordins inhibit both AP-1function and cell proliferationJAnticancer Res1998181A 119-12411 Park SLee D K Whang Y Het al Momordin I a compound of ampelopsis radix inhibits AP-1 activation induced by phorbol esterJCa