土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较.doc

土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较生 命 科 学 与 技 术 学 院 专业 食品科学与工程 学号 2011314003 姓 名 陈莹指 导 教 师 徐 军 韩炎摘要：本实验是微生物学综合性实验项目，包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数）、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等。 1 本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为：细菌/个、放线菌/个、霉菌/个、自生固氮菌/个，说明土壤中微生物种类的繁多和数量的庞大。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物。关键词：分离 纯化 平板菌落计数 微生物的形态1.前言：（1）、微生物在自然界及其在土壤中的分布简况；微生物种类繁多，繁殖迅速，适应环境能力强，因此广泛分布于自然界中，无论是陆地、水体、空气、动植物以及人体的外表面和内部的某些器官，甚至在一些极端环境中都有微生物的存在。 土壤中微生物的数量和种类都很多，包含细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类群。其中细菌最多，约占土壤微生物总量的 70 90 ，放线菌、真菌次之，藻类和原生动物等较少。土壤微生物通过其代谢活动可改变土壤的理化性质，进行物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。 在土壤的不同深度微生物的分布也不相同。其主要原因是由于土壤不同层次中的水分、养料、通气、温度等环境因子的差异，及微生物的特性不同。表面土的微生物数量少，因为这里缺水，受紫外线照射微生物易死亡；在 5 20cm 土壤层中微生物数量最多，若是植物根系附近，微生物数量更多。自 20cm 以下，微生物数量随土层深度增加而减少，至 lm 深处减少约 20 倍，至 2m 深处，因缺乏营养和氧气每克土中仅有几个。 土壤中微生物数量的季节变化是温度、水分、有机残体综合影响的表现。一般，冬季气温低，有些地区土壤几个月呈冰冻状态，微生物数量明显减少。当春季到来，气温回升，随着植物的生长，根系分泌物增加，微生物的数量迅速上升。有的地区，夏季炎热干旱，微生物数量也随之下降，至秋天雨水来临，加上秋收后大量植物残体进入土壤，微生物数量又急剧上升。这样，在一年里土壤中会出现两个微生物数量高峰。 （2）、土壤中各种类群的微生物的含量的大致情况；土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物 5大类群。是土壤生物中数量最多的一类。 细菌,每克表层土壤中约含细菌几百万至几千万个，是土壤菌类中数量最多的一个类群;放线菌,每克表层土壤约含放线菌几十万至几千万个，是数量上仅次于细菌的一个类群;真菌,每克表层土壤只含真菌几千至几十万个，是土壤菌类中数量最少的一个类群，但其生物量指每平方米面积中菌体的重量（克）高于细菌和放线菌;藻类,直径350微米,喜湿，多栖居于土壤表面或表土层中，数量较菌类少。土壤中常见的有绿藻、蓝藻和硅藻。蓝藻中有的种类能固定空气中的氮素。 （3）、土壤中的微生物的作用；土壤微生物在土壤中的作用是多方面的，主要表现在:作为土壤的活跃组成分,土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。同时,土壤作为微生物的生态环境,也影响微生物在土壤中的消长和活性。参与土壤有机物质的矿化和腐殖质化过程；同时通过同化作用合成多糖类和其他复杂有机物质，影响土壤的结构和耕性。土壤微生物的代谢产物还能促进土壤中难溶性物质的溶解。微生物参与土壤中各种物质的氧化还原反应，对营养元素的有效化也有一定作用。参与土壤中营养元素的循环，包括碳素循环、氮素循环和矿物元素循环，促进植物营养元素的有效性。某些微生物有固氮作用，可借助其体内的固氮酶将空气中的游离氮分子转化为固定态氮化物。与植物根部营养关系密切。植物根际微生物以及与植物共生的微生物如根瘤菌、菌根和真菌等能为植物直接提供氮素、磷素和其他矿质元素的营养以及各种有机营养，如有机酸、氨基酸、维生素、生长刺激素等。能为工农业生产和医药卫生事业提供有效菌种，培育高效菌系，如已在农业上应用的有根瘤菌剂、固氮菌剂和抗生菌剂等。某些抗生性微生物能防治土传病原菌对作物的危害。降解土壤中残留的有机农药、城市污物和工厂废弃物等，降低残毒为害。某些微生物可用于沼气发酵，提供生物能源、发酵液和残渣有机肥料。 （4）、本实验的主要过程和实验结果，对实验结果的简单说明和分析，通过实验得到的结论等。本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进行培养与观察，以及制片染色技术等。结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，含有霉菌，细菌，放线菌菌种。通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。 2.材料与方法2.1材料2.1.1土样：以无菌方式采于学校内小园林，置于无菌容器中，待检2.1.2培养基2.1.2.1营养琼脂（牛肉膏蛋白胨固体培养基）1: 牛肉膏 3g/L 蛋白胨10g/L NaCI5g/L 琼脂15-20g/L 水500ml pH 7.0-7.2 121灭菌20min 2.1.2.2高氏一号固体培养基11：可溶性淀粉20g/L 硝酸钾1g/L氯化钠0.5g/L磷酸氢二钾0.5g/L硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂20g/L 水500ml pH 7.2-7.4 配置时，先用少量冷水，把淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至500ml ，121灭菌20min,灭菌后，在100ml培养基中加入10%酚溶液5滴（作为抑制剂，以抑制细菌的生长），制备平板备用。2.1.2.3查氏固体培养基1：硝酸钠2g/L磷酸氢二钾1g/L硫酸镁(MgSO47H2O)0.5g氯化钾0.5g/L硫酸亚铁0.01g/L蔗糖30g/L琼脂15-20g/L水500mL pH自然分装后121灭菌20min 2.1.2.4马丁氏培养基：1：KH2PO4 1g/L MgSO47H2O 05g/L 蛋白胨 5g/L 葡萄糖 10g/L 琼脂 1520g/L 蒸馏水 500ml pH 自然1/3000孟加拉红水溶液 33mg/L 121灭菌30min 临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml,使每毫升培养基中含链霉素30ug 2.1.2.5无菌水：装有90ml蒸馏水和数拾粒玻璃珠的250ml锥形瓶一只，装有9ml蒸馏水的18180mm试管数支；121.3， 20分钟灭菌，备用2.1.3染色液2.1.3.1革兰氏染色液1 草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等2.1.3.2 0.1%美蓝1 用于放线菌菌丝形态观察2.1.3.3乳酸石炭酸棉蓝液1 A液：碱性复红(basic fuchsin) 03g 95%酒精 10ml B液：石炭酸 50g 蒸馏水 95ml 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。 将石炭酸溶解于水中，配成B液。 混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释510倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。用于霉菌形态观察2.2方法2.2.1制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。静置，成为土壤悬液(10-1)。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀(10-2)。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中(10-3)，依此类推制成10-4，10-5，10-6，10-6各种稀释度的土壤溶液。 2.2.2制备及涂布平板 用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.1平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。 用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-6、10-5和10-4的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.2平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。 用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-5、10-4和10-3的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.3平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。 用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-5、10-4和10-3的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.1平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。 2.2.3培养培养基2.1.2.1平板倒置于37培养箱，23天；培养基2.1.2.2平板倒置于28培养箱57天；培养基2.1.2.3和培养基2.1.2.4平板倒置于28培养箱35天； 2.2.4菌落计数 培养结束后，根据不同类群的微生物的菌落特征，分别在不同的培养基平板上统计相关类群的微生物菌落，即培养基2.1.2.1统计细菌的菌落；培养基2.1.2.2统计放线菌的菌落；培养基2.1.2.3和培养基2.1.2.4统计霉菌的菌落。由下式计算每克土壤中相关微生物的菌落形成单位（cfu）： 个/克=同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数52.2.5挑单菌落 从不同的培养基平板上，选取细菌、放线菌和霉菌各三个菌落分别转接到营养琼脂、高氏一号、查氏培养基斜面中，每个菌落接两支斜面试管，编号标记，分别置培养箱培养，备用2.2.6细菌的革兰氏染色和形态观察 对从2.2.5中选出的细菌分别做革兰氏染色，观察记录三株细菌的革兰氏染色结果和个体形态2.2.7放线菌的插片培养和形态观察 对从2.2.5中选出的放线菌分别做平板划线、插片培养，培养后观察记录三种放线菌的菌丝形态。每个平板中，以约45角将1-2片无菌盖玻片斜插入平板上第一次划线的部位。2.2.8霉菌的点植培养和形态观察 对从2.2.5中选出的霉菌分别做点植培养，每个平板上点植接种三个点，培养后制片，观察、记录三种霉菌的菌丝和产无性孢子的子实体的形态3.结果3.1土壤样品中细菌、放线菌、霉菌的菌落形成单位（cfu）见表1、表2、表3： 表1 细菌稀释度10-510-610-7各重复的菌落数18232161213213931cfu/克4.22*106 2.93*1071.62*108平均（cfu/克）6.52*107表2 放线菌稀释度10-410-510-6各重复的菌落数13600212903546cfu/克1.38*1052.83*1051.5*106平均（cfu/克）6.40*105 表3霉菌稀释度10-310-410-5培养基2.1.2.32.1.2.42.1.2.32.1.2.42.1.2.32.1.2.4各重复的菌落数1380270128651308395521000cfu/克06.33*1041.33*1041051.5*1052*105 3.1.1细菌是，形成的菌落小；细菌个体之间充满着水分，整个菌落显得湿润，易被接种环挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛细菌常形成边缘不规则的菌落；具有荚膜的菌落表面较透明，边缘光滑整齐；有芽孢 的菌落表面干燥皱褶；有些能产生色素的细菌菌落还显出鲜艳的颜色。3.1.2放线菌菌落特征：菌落干燥、不透明，表面呈致密的丝绒状，其上有一层彩色，主要为粉红色的“干粉”，菌落和培养基连接紧密，难以挑取，其正反面颜色不一致。正面为粉红色，而反面为乳白色，在菌落边缘的琼脂平面有变形现象。3.1.3曲霉菌落特征：菌落较大，质地疏松，外观干燥而不透明，菌落与培养基连接紧密，不易挑取，其正反面颜色不同，边缘不整齐，其正面为淡黄色，反面为黄色。高度较高，隆起。3.1.4根霉菌落特征：菌落无定形，为絮状，高度很高，覆盖整个培养皿，质地疏松，外观干燥为褐色、不透明。菌落与培养基连接紧密，不易挑取。3.2分离的三株细菌的革兰氏染色结果及形态见表4：3.3分离的放线菌的形态见图1：3.4分离的霉菌的形态见图2：表4菌株编号革兰氏染色结果菌体形态1G- 球菌2G-杆菌3G+球菌子囊孢子气生菌丝基内菌丝C-4-f-02 放线菌的形态特征 图1C-5-m-1 C-4-m-01图24.讨论4.1结果3.1说明土壤中分布着种类繁多和数量巨大的微生物。没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。自然界中，在大多数场合微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离 4.2结果3.2培养基中的某些组分对富集、分离和纯化特定的微生物有较重要的作用4.3 实验的结论性的小结微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个菌)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。在实验中通过配置不同浓度的培养基，用于所采集土壤样品中微生物的接种，经过培养后，进一步使用选择培养基对培养菌种进行培养，以达到分离各种微生物的目的。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。进行分离时常用的方法有：1).