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文档简介

原位杂交技术一、 概述（一） 概念：原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization )的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。是将分子杂交与组织学相结合的一项技术，也称之为杂交组织化学(hybridization histochemistry)、细胞杂交(cytological hybridization)或原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry)。（二） 历史和现状可以检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA序列。二、 原位杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子(DNA , RNA)的碱基对形成氢键的互补性(A=T , A=U , C=G)，用一标记的核酸探针去检测与之碱基互补的靶核酸，这与免疫学中抗原抗体的反应相似。优点：分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片。应用范围广泛，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。三、 探针(probe)是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。（一） 探针种类、来源和应用1. 双链cDNA探针2. 单链cDNA探针3. 寡核苷酸探针4. cRNA探针（二） 探针标记的种类1. 放射性标记 2. 非放射性标记 最常用的为生物素(光敏生物素、补骨脂素生物素)和地高辛(digxigenin , DIG)，此外还有荧光素、酶类，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。（三） 探针标记的方法1. 切口移位法 亦称缺口平移法，是常用的标记DNA的方法。最常用的标记物为32P，也可用地高辛和生物素进行标记。2. 引物延伸法(primer extension)此法产量低，可标记纯度不太高的DNA。3. 末端标记法(end - labeling) 分为5末端和3末端标记。此法适用于
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