胡小梅_XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与基因定位

序号： 编码： 第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称：XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 胡小梅 邓杏 陈月柳 彭景芳 赵娟 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类说 明1申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4序号、编码由第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.522cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）；2本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。申报者代表情况姓名胡小梅性别女出生年月1990年9月学院农学院系别、专业、年级08农业生物技术2班学历在读本科学制4入学时间2008年9月作品名称XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位毕业论文题目无通讯地址广州市华南农业大学启林南区39栋邮政编码510642办公电住地通讯地址广州市华南农业大学启林南区39栋邮政编码510642住宅电他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位陈月柳女21在读本科华南农业大学农学院彭景芳女21在读本科华南农业大学农学院赵娟女21在读本科华南农业大学农学院邓杏女21在读本科华南农业大学农学院资格认定学院学籍管理部门意见以上作者是否为2011年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是 否 （部门签章）年 月 日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是 否负责人签名：年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。作品全称XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位（学术论文）作品分类（ D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路水稻是我国最重要的粮食作物，直链淀粉含量过高已成为制约南方早籼和杂交稻品质改良的关键因素之一，目前单一的Wx复等位基因已无法满足籼稻品质改良需求，因此，发掘和创造籼型非Wx低直链淀粉水稻突变体，明确其遗传机理和基因功能，具有重要的理论和实践意义。前期研究表明，籼稻突变体XLA-1低直链淀粉性状由非Wx低直链淀粉突变基因控制。本项目在前期研究基础上,利用特异性功能引物鉴定XLA-1含有的突变基因与野生型Wx基因差异；运用遗传学手段明确XLA-1低直链淀粉突变基因与Wx基因的互作关系，阐明其遗传机理；利用分子生物学手段定位XLA-1低直链淀粉突变基因，并获得与其紧密连锁的分子标记，为水稻品质改良提供理论依据和种质材料。作品的科学性、先进性及独特之处科学性：Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）是直链淀粉合成的关键酶，其具有一系列复等位基因，从而影响直链淀粉含量高低，是目前生产上利用的最主要的基因资源。在育种实践上，由于直链淀粉性状属于三倍体遗传，因此利用Wx复等位基因改良水稻直链淀粉含量难度较大。如在高AAC与低AAC的杂交后代中能出现中等AAC的个体，但这种个体的基因型是杂合的，后代还会出现继续分离9，最终产生的是与亲本AAC相似的纯合体，育种选择周期长、效果差。如果利用非Wx低直链淀粉基因资源，由于遗传重组的存在，在杂交后代中可以较快得到中等直链淀粉含量的纯合体。先进性：本实验室利用空间诱变技术，经过长期观察筛选，已经得到多个籼型低直链淀粉含量突变体，这些突变体的获得为深入阐明水稻直链淀粉调控机理奠定了材料基础。本项目通过突变体精细定位分离克隆控制水稻低直链淀粉相关基因或QTL，并获得与其紧密连锁的分子标记，项目研究成果不仅能为优质水稻分子育种技术平台提供有利的品质基因资源，而且可为深入理解籼稻直链淀粉调控机理提供理论依据。独特之处：本研究所用材料为籼型非Wx低直链淀粉调控基因，目前国内有关籼稻低直链淀粉研究报道较少。本研究不仅材料上具有创新性，而且对揭示籼稻直链淀粉性状的调控及分子机理具有较大的理论意义。作品的实际应用价值和现实意义水稻是禾本科作物基因组研究的模式植物，目前在水稻中已经报道的淀粉合成相关基因有20多个, 但这些基因如何相互作用调控淀粉的含量与结构尚未明确发现，因此，非Wx低直链淀粉基因的精细定位和克隆对研究禾本科作物的淀粉合成机理和品质育种具有重要的意义。可根据此结果育出稳定遗传的直链淀粉含量低的水稻品种，若用于生产则大大地解决了人们对于米饭口感品质的要求。也可将此基因克隆转入其他品种来改善其品质或者利用常规育种将此基因顺利导入其它高产优质的水稻种育出更好的品种。学术论文文摘摘要：在前期研究基础上，本研究以低直链淀粉突变体XLA-1为材料，利用SSR标记与作图群体，在第6染色体上端定位了一个非Wx基因lac（暂命名），该基因位于SSR标记RM19288、RM19297之间，遗传距离分别为5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通过与已定位的低直链淀粉突变基因位置比对，初步表明lac为一新的籼稻低直链淀粉含量基因。通过该基因的获得，丰富了籼稻的低直链淀粉基因资源，也为该基因的精细定位和图位克隆研究打下了良好的基础 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励获2011年华南农业大学“丁颖杯”课外学术科技作品竞赛二等奖鉴定结果（1）明确XLA-1低直链淀粉突变特性遗传机理；（2）将籼型非Wx低直链淀粉突变基因lac定位于两个分子标记间，遗传距离均小于5cM。请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1 胡培松, 翟虎渠, 万建民,等. 中国水稻生产新特点与稻米品质改良. 中国农业科技导报, 2002, 4(4):33-39.2 I. Mikami , N. Uwatoko, Y. Ikeda, et al. Allelic diversification at the wx locus in landraces of Asian rice. Theor Appl Genet, 2008, 116:979-989.3 何凤华,曾瑞珍,席章营,等.不同Wax 基因型水稻的遗传多样性.分子植物育种,2003,1(2):179-186.4 舒庆尧,吴殿星,夏英武,等.籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与表观直链淀粉含量的关系.遗传学报,1999，26(4)：350-358.5 张建勇，陈德全 李仕贵，马玉清，等 。利用分子标记鉴定水稻品种的Wx等位基因及其与直链淀粉含量的关系 作物学报 2005，046 包劲松 舒庆尧 吴殿星等 水稻Wx基因（CT）n微卫星标记与稻米淀粉品质的关系研究 农业生物技术学报 2000.8（3）241-244申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）申报论文一篇XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位申报书一份科研管理部门签章年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。直链淀粉含量在 5%-15%之间的低直链淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之间的中间类型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特点，是改良稻米直链淀粉含量和食味品质的理想材料。目前已经报道了20多种低直链淀粉突变体,其直链淀粉均低于15%，胚乳外观表型多为半透明或不透明，少数为透明的1。日本、韩国等东亚国家偏食软性粳米，故对低直链淀粉含量水稻育种非常重视。日本自20世纪80年代中期开始进行低直链淀粉突变体诱变筛选和育种计划，相继育成Milky Queen、Sari 等一系列优质低直链淀粉含量品种，深受商家和消费者欢迎。Milky Queen是日本在1991年育成的低直链淀粉水稻品种，它是用N甲基N 亚硝基脲（MNU）处理“越光”的受精卵，获得的低直链淀粉含量突变体,其直链淀粉含量为9%-12%。我国对低直链淀粉含量水稻品种选育的重视程度相当不够。我国云南地区特有的软米品种,是野生稻中自然发生的低直链淀粉含量突变体，直链淀粉含量在8%-15%之间2。目前我国发现的低直链淀粉突变体大多数为粳稻类型，有关籼稻类型的低直链淀粉突变体报道较少。根据与Wx基因等位性关系的不同，可将目前已报道的低直链淀粉含量突变体分为与Wx等位和非等位两大类。其中Wx-mq，Wxop等属于与Wx等位的低直链淀粉含量基因，而du,lam(t)等属于与Wx非等位的基因。Wx-mq发现于日本培育的低直链淀粉栽培品种Milky Queen中,经研究控制Milky Queen的低直链淀粉含量的基因是1个Wx的等位基因,并命名为Wx-mq3，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊尔水稻品种中发现的不透明胚乳自然突变体,籽粒外观与糯稻相似,直链淀粉含量在10%左右,研究发现其低直链淀粉含量由1个隐性单基因控制,与Wx基因等位,将其命名为Wxop5。 du基因是独立于Wx的隐性单基因，该类型突变基因表型胚乳均为半透明，现已发现8个du基因,分别命名为du-1，du-2，du-3,du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)， du(EM47)位于第6染色体，du-4 du-1 du(2120)分别位于第4,7,9染色体上6-8。lam(t)基因来源于北海道品种Shiokari，该基因为与Wx不等位的隐性单基因，位于第9染色体4。我国云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷的低直链淀粉性状均由Wx复等位基因Wxhp控制9。目前du-1基因已被克隆10，尚未见到其它与Wx非等位低直链淀粉基因的克隆报道。对于水稻直链淀粉含量变化的分子机理，目前的研究主要集中于Wx复等位基因，有关非Wx低直链淀粉基因的调控机理研究较少。水稻中主要存在Wxa和Wxb两种等位基因11，Wxa等位基因广泛存在于籼稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白积累量主要和第一内含子的剪接效率有关12，Aryes等13设计了SNP标记484/w2r用于分析直链淀粉含量变异。另外，该剪接位点上游存在一个(CT)n重复序列，序列重复次数与直链淀粉含量具有很高的相关性,籼稻品种(CT)n重复次数相对较少，粳稻相对较多，并根据此序列设计了特异性微卫星引物484/48514。上述研究主要针对直链淀粉含量介于15-25%之间的常规水稻品种，但这些结果仍不能很好解释直链淀粉含量水平的多样性，尤其是低直链淀粉含量形成机制，郭涛等15的研究表明，籼型低直链淀粉突变体XLA-1,XLA-2（CT）n多态性与糯稻相同，但其直链淀粉含量明显高于糯稻，说明还存在其它直链淀粉调控机制。在有关低直链淀粉合成调控机理方面，Zeng等9通过图位克隆的方法得到了Du-1基因的全长序列，分析表明，du-1基因与其野生型在第一外显子（+1742）处存在一个碱基替换（碱基G突变为A），从而导致了氨基酸序列错义突变（丝氨酸突变为天门冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一个淀粉合成的调节因子，通过影响Wxb基因前体mRNA的剪接效率而降低直链淀粉含量。Isshhiki等16的研究表明，du-1和du-2不能形成类似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前体mRNA的正确剪接过程受到一定影响，从而导致直链淀粉含量降低。Sato等17克隆了Wx-mq全长cDNA，与野生型Wxb基因相比，在编码区发生了2个碱基的替换，497位的G变为A，595位的T变为C，从而使相应的氨基酸序列产生了2个错义突变，推测这2个错义突变是造成直链淀粉含量下降的原因。马晓东9的研究表明，四个云南软米低直链淀粉基因均由Wx复等位基因Wxhp控制，该基因编码区第四外显子（+497个）处存在一个单碱基突变（碱基A突变为G），编码子由GAC突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸，单核苷酸突变可能导致其空间构象发生变化，不能充分结合在淀粉粒上催化直链淀粉的形成，从而导致直链淀粉含量降低。以上研究均来源于粳稻低直链淀粉突变体，由于籼型非Wx低直链淀粉突变基因的克隆尚未报道，因此籼稻低直链淀粉合成机制有待进一步研究。综上所述，低直链淀粉合成、加工和沉积途径的分子机制目前仍尚未明晰，因此获得各种类型的直链淀粉含量突变体（特别是籼型低直链淀粉突变体），通过各种方法克隆控制突变性状的基因是解决上述问题的一个有效措施，并可为稻米直链淀粉改良提供优良的遗传资源。本实验室利用空间诱变技术，已经得到多个籼型低直链淀粉含量突变体18，这些突变体的获得为深入阐明籼稻直链淀粉调控机理奠定了材料基础。参考文献1 朱昌兰，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直链淀粉含量基因育种利用的研究进展. 中国农业科学 2004，37(2):157-162. 2 曾亚文,申时全,杨忠义,等.云南稻种资源的蒸煮食味品质研究.西南农业大学学报,2001,23(5):408-413 Sato H, Suzuki Y, Okuno K, et al. Genetic analysis of low-amylose content in a rice variety Milky Queen. Japan Breeding Research, 2001, 3:13-19.4 Sato H. Status and perspectives on the researches of low amylose content rice. Japan Agriculture and Horticulture, 2002, 77(5):20-28.5 Mikami I, Aikawa M , Hirano H Y, et al. Altered tissue-specific expression at the Wx gene of opaque mutants in rice. Euphytica, 1999, 105:91-97.6 Okuno K, Nagamine T, Oka M. New lines harboring du genes for low amylase content in endosperm starch of rice. Japan Agricultural Research Quarterly, 1993, 27:102-105.7 Yano M, Okuno K, Sato H, et al. Chromosomal location of genes conditioning low amylase content of endosperm starches in rice (Oryza sativa L.).Theoretical and Applied Genetics, 1988, 76:183-189.8 Kaushik P P, Khush G S. Genetic analysis of endosperm mutants in rice, Oryza sativa L. Theoretical and Applied Genetics, 1991,83:146-152.9 马晓东.四个云南软米水稻品种低直链淀粉含量形成机制研究. 南京农业大学硕士学位论文,2007,p1.10 Dali Zeng , Meixian Yan, Yonghong Wang, et al. Du1, encoding a novel Prp1 protein, regulates starch biosynthesis through affecting the splicing of Wxb pre-mRNAs in rice (Oryza sativa L.). Plant Mol Biol, 2007, 65:501-509.11 SanoY. Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm. Theor Appl Genet，1984，68:467-473.12 Hirano H Y, Sano Y. Enhancement of Wx gene expression and the accumulation of amylase in response to cool temperatures during seed development in rice. Plant cell physiol, 1998, 39(8):807-812.13 Ayres N M, Mcclung A M, Larkin P D, et al. Microsatellites and a single-nucleotide polymorphism differentiate apparent amylase classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theor Appl Genet, 1997, 94:773-781.14 Bligh H F, Till R L, JONES C A. A micro satellite sequence closely linked to the waxy gene of Oryza sativa . Euphytica, 1995, 86:83-85.15 郭涛,韦璇,王慧, 等. 2个低直链淀粉含量籼稻突变体的遗传分析. 华南农业大学学报,2009,30(1):10-13.16 Isshiki M, Nakajima M, Sato H, et al. Dull: rice mutants with tissue-specific effects on the splicing of the waxy pre-mRNA. The Plant Journal, 2000, 23(4):451-460.17 Sato H, Suzuki Y, Sakai M, et al. Molecular characterization of Wx-mq, a novel mutant gene for low amylose content in endosperm of rice (Oryza sativa L.). Breeding Science, 2002, 52:131-135.18 郭涛,蔡金洋,王慧,等.水稻空间诱变SP2代品质性状变异分析.华南农业大学学报,2007,28(1):6-9.D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写；2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）；3推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名陈志强性别男年龄46职称教授（博导）工作单位国家植物航天育种工程技术研究中心通讯地址华南农业大学科技楼711室邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章本实验课题组共同推荐该作品参与“挑战杯”作品竞赛 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述胡小梅同学的参赛作品XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位是该同学承担的科技创新计划（已结题）项目研究内容之一。胡小梅同学及其组员在我“中心”实验室开展了大量的品质分析、分子生物学相关试验，方法科学、数据翔实可靠。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价水稻是禾本科作物基因组研究的模式植物，目前在水稻中已经报道的淀粉合成相关基因有20多个, 但这些基因如何相互作用调控淀粉的含量与结构尚未明确发现，因此，非Wx低直链淀粉基因的精细定位和克隆对研究禾本科作物的淀粉合成机理和品质育种具有重要的意义。该作品在籼稻中鉴定出一个非Wx直链淀粉调控因子，在理论及实践上均具有较大意义。其它说明推荐者情况姓 名刘向东性别男年龄43职称教授（博导） 工作单位华南农业大学农学院分子遗传育种重点实验室通讯地址华南农业大学农学院818室邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述胡小梅同学及其组员在农学院航天育种实验室开展了参赛作品XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位的主体实验工作，实验中采用的遗传分析和基因定位方法得当，经审阅其调查记录，该作品数据真实、可靠，结果准确。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价作品通过分析低直链淀粉突变体与野生型Wx基因的多态性关系，对糯稻的低直链淀粉基因进行了分子标记和遗传分析。作品选题具有意义，使用分析技术合适。试验结果丰富了水稻的低直链淀粉基因资源，对改良高直链淀粉材料的育种实践具有一定的价值。其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位胡小梅 彭景芳 赵娟 陈月柳 邓杏摘要：在前期研究基础上，本研究以低直链淀粉突变体XLA-1为材料，利用SSR标记与作图群体，在第6染色体上端定位了一个非Wx基因lac（暂命名），该基因位于SSR标记RM19288、RM19297之间，遗传距离分别为5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通过与已定位的低直链淀粉突变基因位置比对，初步表明lac为一新的籼稻低直链淀粉含量基因。通过该基因的获得，丰富了籼稻的低直链淀粉基因资源，也为该基因的精细定位和图位克隆研究打下了良好的基础。关键词： XLA-1 低直链淀粉基因 遗传分析 分子定位 Summary:Based on the published Wx gen e sequence analysis, a pair of specific primer (484/485) were used to amplify the full-length sequence of Wx gene from the mutant. Sequencing analysis showed Wx gene polymorphism between the low amylose mutant and wild-type. To explain the genetic mechanism of the mutant gene, the mutant XLA-1 hybrided separately with the wild, high amylose parents, glutinous rice. The separation of amylose traits in F1, F2, BCF1 population were analysed. The large populations of F2 generation were obtained by the hybridization of XLA-1 with medium- and high amylose parents, respectively. The genetic distance between the molecular markers and the mutant gene were calculated from F2 generation of low amylose individual plants by use of the stealth group method and molecular marker linkage analysis of the mutant genes. Keywords： XLA-1 contents of amylase hidden groups molecular genetic markers genetic analysis 水稻是我国第一大粮食作物，其总产量与播种面积列世界第一，二位【1】。近年来农产品的产量不断提高，人们对于大米的品质的要求越来越高。而影响大米口感的一个重要因素就是水稻中直链淀粉含量，相对来说，直链淀粉含量越低，食味品质较好。研究表明除栽培条件对稻米中直链淀粉含量有影响外，直链淀粉在不同品种之间的含量差异是可遗传的特性【2】，即水稻中直链淀粉含量是由基因控制的。直链淀粉含量在 5%-15%之间的低直链淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之间的中间类型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特点，是改良稻米直链淀粉含量和食味品质的理想材料。目前已经报道了20多种低直链淀粉突变体,其直链淀粉均低于15%，胚乳外观表型多为半透明或不透明，少数为透明的3。日本、韩国等东亚国家偏食软性粳米，故对低直链淀粉含量水稻育种非常重视。日本自20世纪80年代中期开始进行低直链淀粉突变体诱变筛选和育种计划，相继育成Milky Queen、Sari 等一系列优质低直链淀粉含量品种，深受商家和消费者欢迎。Milky Queen是日本在1991年育成的低直链淀粉水稻品种，它是用N甲基N 亚硝基脲（MNU）处理“越光”的受精卵，获得的低直链淀粉含量突变体,其直链淀粉含量为9%-12%。我国对低直链淀粉含量水稻品种选育的重视程度相当不够。我国云南地区特有的软米品种,是野生稻中自然发生的低直链淀粉含量突变体，直链淀粉含量在8%-15%之间4。目前我国发现的低直链淀粉突变体大多数为粳稻类型，有关籼稻类型的低直链淀粉突变体报道较少。根据与Wx基因等位性关系的不同，可将目前已报道的低直链淀粉含量突变体分为与Wx等位和非等位两大类。其中Wx-mq，Wxop等属于与Wx等位的低直链淀粉含量基因，而du,lam(t)等属于与Wx非等位的基因。Wx-mq发现于日本培育的低直链淀粉栽培品种Milky Queen中,经研究控制Milky Queen的低直链淀粉含量的基因是1个Wx的等位基因,并命名为Wx-mq5，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊尔水稻品种中发现的不透明胚乳自然突变体,籽粒外观与糯稻相似,直链淀粉含量在10%左右,研究发现其低直链淀粉含量由1个隐性单基因控制,与Wx基因等位,将其命名为Wxop6。 du基因是独立于Wx的隐性单基因，该类型突变基因表型胚乳均为半透明，现已发现8个du基因,分别命名为du-1，du-2,du-3，du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)， du(EM47)位于第6染色体，du-4 du-1 du(2120)分别位于第4,7,9染色体上7-9。lam(t)基因来源于北海道品种Shiokari，该基因为与Wx不等位的隐性单基因，位于第9染色体10。我国云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷的低直链淀粉性状均由Wx复等位基因Wxhp控制11。目前du-1基因已被克隆12，尚未见到其它与Wx非等位低直链淀粉基因的克隆报道。对于水稻直链淀粉含量变化的分子机理，目前的研究主要集中于Wx复等位基因，有关非Wx低直链淀粉基因的调控机理研究较少。水稻中主要存在Wxa和Wxb两种等位基因13，Wxa等位基因广泛存在于籼稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白积累量主要和第一内含子的剪接效率有关14，Aryes等15设计了SNP标记484/w2r用于分析直链淀粉含量变异。另外，该剪接位点上游存在一个(CT)n重复序列，序列重复次数与直链淀粉含量具有很高的相关性,籼稻品种(CT)n重复次数相对较少，粳稻相对较多，并根据此序列设计了特异性微卫星引物484/48516。上述研究主要针对直链淀粉含量介于15-25%之间的常规水稻品种，但这些结果仍不能很好解释直链淀粉含量水平的多样性，尤其是低直链淀粉含量形成机制，郭涛等17的研究表明，籼型低直链淀粉突变体XLA-1,XLA-2（CT）n多态性与糯稻相同，但其直链淀粉含量明显高于糯稻，说明还存在其它直链淀粉调控机制。在有关低直链淀粉合成调控机理方面，Zeng等18通过图位克隆的方法得到了Du-1基因的全长序列，分析表明，du-1基因与其野生型在第一外显子（+1742）处存在一个碱基替换（碱基G突变为A），从而导致了氨基酸序列错义突变（丝氨酸突变为天门冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一个淀粉合成的调节因子，通过影响Wxb基因前体mRNA的剪接效率而降低直链淀粉含量。Isshhiki等19的研究表明，du-1和du-2不能形成类似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前体mRNA的正确剪接过程受到一定影响，从而导致直链淀粉含量降低。Sato等20克隆了Wx-mq全长cDNA，与野生型Wxb基因相比，在编码区发生了2个碱基的替换，497位的G变为A，595位的T变为C，从而使相应的氨基酸序列产生了2个错义突变，推测这2个错义突变是造成直链淀粉含量下降的原因。马晓东18的研究表明，四个云南软米低直链淀粉基因均由Wx复等位基因Wxhp控制，该基因编码区第四外显子（+497个）处存在一个单碱基突变（碱基A突变为G），编码子由GAC突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸，单核苷酸突变可能导致其空间构象发生变化，不能充分结合在淀粉粒上催化直链淀粉的形成，从而导致直链淀粉含量降低。以上研究均来源于粳稻低直链淀粉突变体，由于籼型非Wx低直链淀粉突变基因的克隆尚未报道，因此籼稻低直链淀粉合成机制有待进一步研究。综上所述，低直链淀粉合成、加工和沉积途径的分子机制目前仍尚未明晰，因此获得各种类型的直链淀粉含量突变体（特别是籼型低直链淀粉突变体），通过各种方法克隆控制突变性状的基因是解决上述问题的一个有效措施，并可为稻米直链淀粉改良提供优良的遗传资源。本实验室利用空间诱变技术，已经得到多个籼型低直链淀粉含量突变体21，这些突变体的获得为深入阐明籼稻直链淀粉调控机理奠定了材料基础。韦璇21对空间诱变材料籼小占的低直链淀粉突变体XLA-1与高直链淀粉品种华航一号杂交的遗传分析表明，XLA-1与高直链淀粉亲本杂交的F2代籽粒直链淀粉出现高低分离，且分离比例不符合3：1的分离模式，初步推测XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制，它们具有连锁关系和互补作用，这2对基因1对可能是Wx的等位基因，另一对可能是与Wx不等位的基因，两者均控制直链淀粉合成过程中的某一个环节，任何1对基因隐性纯合都将导致直链淀粉含量降低；XLA-1与糯稻的杂交后代出现许多介于双亲之间及超亲的高直链淀粉含量籽粒，初步证明另1对突变基因为非 Wx的基因位点（暂命名为lac）。从淀粉合成关键酶的角度分析，XLA-1的直链淀粉含量下降的主因与SBE酶活性的增大关系密切。在前期研究基础上，本研究对XLA-1中所含有的非Wx突变基因lac进行初步定位，研究结果对丰富水稻品质育种基因资源具有一定的理论和实践价值。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1水稻供试材料利用分子标记从XLA-1/华航一号F2代群体中筛选出的目的基因型低直链淀粉含量品系，该品系的直链淀粉特性受非Wx基因lac调节（基因型为WxWxlaclac）,命名为HXLA。高直链淀粉个体：籼小占（WxWxLacLac）1.2 实验方法1.2.1 杂交设计2009年6月，以低直链淀粉种质HXLA为母本与高直链淀粉亲本籼小占为父本杂交，获得F1种子，2009年晚造自交得到F2籽粒群体。1.2.2 杂交方法采用温烫去雄法杀雄，上午8时至11时进行。首先在保温瓶中灌满45的温水，在稻穗开花前半小时左右，把稻穗压弯轻轻浸入温水中浸泡5-8min，然后取出稻穗，将闭合的小穗全部除去，防止假杂种；凡开花的小穗，其雄蕊没有活力，而雌蕊仍保持活力，去除雄蕊，为方便授粉将其尾部三分之一的颖壳剪去，套袋。待父本开花后，剪取正在开花的稻穗，采用震动授粉法对母本授粉。授粉后将纸袋折叠，套上标签，约一个月后收取杂交种子。1.2.3 稻米直链淀粉含量的测定方法集团法：参照GB-7648-87法，用SDM-A型旋风式磨粉机将待测试样的整经米磨成粉，称取1000.5mg米粉样品加入100mL容量瓶，加入1.0mL=95%酒精使其分散，9.0mL 1mol/L NaOH煮沸10min，冷却定容，吸取5.0mL样品溶液移入另一100mL容量瓶（同时吸取5.0mL 0.09mol/L NaOH作为对照），加入1.00 mL 1mol/L乙酸、1.50mL I2-kI溶液，定容，20min后用分光光度计测定620nm下吸光值（OD620nm）。集团法标准曲线绘制：称取与待测样品保存在同样的条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各100mg，用上述方法与待测样品同时进行测定。以标样的直链淀粉为纵坐标，以相应的吸光值为横坐标，绘制标准曲线和列出曲线的回归方程式。重复测定一次，两次结果的误差应在1.0%，取平均值即为直链淀粉含量。单粒法：将单粒去壳去胚后，放入25mL容量瓶，加入0.25mL=95%酒精及2.25mL 1mol/L NaOH后，置于恒温箱26糊化24h，使胚乳完全溶解。之后将容量瓶取出，振荡摇匀后煮沸10min，冷却定容吸取1.25mL样品溶液移入另一25mL容量瓶（同时吸取1.25mL 0.09mol/L NaOH作为对照），加入0.25 mL 1mol/L乙酸、0.375mL I2-kI溶液，定容，20min后用分光光度计测定620nm下吸光值（OD620nm）。 单粒法标准曲线绘制：称取高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各0.0100g，用上述方法与待测样品进行测定。以表样直链淀粉质量分数为纵坐标，以相对应的吸光值为横坐标，绘制标准曲线和列出曲线的回归方程式。亲本的直链淀粉含量及HXLA/籼小占F1单株测定采用集团法，HXLA/籼小占F2的遗传分析采用单粒法。1.2.4 作图群体的DNA获得HXLA/籼小占的F2籽粒群体采用单粒法测定，把单粒分成两部分，胚乳用于直链淀粉含量的测定，保留胚，并编号一一对应。把小于13.5%及大于22.5%的籽粒胚置于恒温箱发芽，用营养液浇灌至三叶期，长出足够多的叶片可提取DNA，用于构建作图群体。1.2.5 水稻基因组总DNA提取采用Murray CTAB方法提取。1.2.6 SSR标记筛选及候选基因标记确定韦璇21等利用XLA-1/华航一号杂交构建F2代群体，经遗传分析和蜡质基因Wx的(CT)n多态性分析表明，控制XLA-1低直链淀粉特性的另一对基因与Wx基因连锁。根据上述研究，为快速确定该低直链淀粉基因，首先采用分离群体法（Bulked Segregant Analysis, BSA）筛选与低直链淀粉基因连锁的微卫星标记，即利用HXLA与籼小占及高直链淀粉池与低直链淀粉池作为筛选模板进行扩增，待筛选出合适的SSR标记后进一步对高直链淀粉个体及低直链淀粉个体进行确定，确保标记的准确性。候选标记确定后，再根据隐性群体法（Recessive-class analysis, RCA）对F2作图群体的低直链淀粉个体进行确定，确定连锁位置与遗传距离。1.2.7 近等基因池的构建从HXLA/籼小占F2代定位群体中随机选取10个高直链淀粉籽粒个体的DNA等量混合成高直链淀粉基因池，同样方法选取10个低直链淀粉籽粒个体的DNA等量混合成低直链淀粉基因池。1.2.8 电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，大约3-4小时，结束后，双蒸水洗胶两次，每次约1分钟，再用1g/L的AgNO3溶液染色约10分钟，用双蒸水洗胶两次，用显影液摇动显影然后观察分析。1.2.9 连锁分析本研究采用隐性群体法进行连锁分析，重组率按Kosambi作图函数转换成遗传距离（里摩尔根cM）。2 结果分析2.1 F1代直链含量测定结果从表2.1可以看出，HXLA与籼小占杂交得到的F1代籽粒直链淀粉含量居于双亲之间，其籽粒直链淀粉含量平均值低于中亲值（20.95%21.65%），且多数偏向于高直链淀粉含量亲本，说明高直链淀粉含量对低直链淀粉含量表现不完全显性，控制XLA-1低直链淀粉含量的突变基因属于隐性基因。表2.1 HXLA/籼小占F1代及亲本直链淀粉含量表现值组合直链淀粉含量（%）F1MPF1-MPHXLA /籼小占17.4124.3720.9521.650.182.2 F1代真种的分子标记鉴定XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制，因此要排除Wx基因的影响，此外还要验证杂交是否成功，本研究采用分子标记辅助的方法，对F1的植株逐一进行检测，保证遗传分析及分子定位的准确性。首先采用特异引物484/485特异引物进行(CT)n多态性鉴定，如图2.1所示，选取只有和双亲相同带型的植株，即编号为1、2、3、8、9；接着用双亲具有多态的引物RM225进行鉴定，如图2.2所示，选取杂合带型的植株，即编号为1、4、5、6、7、9、10。综合筛选满足条件的有1号植株，因此选取1号进行遗传分析及分子定位。P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图2.1 HXLA/